常用分子生物学技术的原理及应用ppt课件.ppt

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1、第二十一章常用分子生物学技术原理及其应用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:principleandapplication第一节分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)指具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单链在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的过程。杂交双链(heteroduplex)利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到特定的支持物上，使之成为固相化分子，称之为印迹（blotting）。印迹

2、（blotting）（一）Southern印迹杂交Southern印迹杂交（Southernblotting）DNA与DNA分子之间的杂交。基本过程:将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。探针（probe）是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段。探针的种类寡核苷酸基因组DNAcDNA片段RNA片段标记物放射性同位素生物素荧光染料Southern印迹杂交的基本步骤待测DNA

3、样品的限制性内切酶消化酶切DNA样品的电泳分离凝胶中DNA的变性和Southern转移探针的制备Southern杂交杂交结果的检测10×SSC转移缓冲液Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g与探针同源杂交的基因DNA片段基因组DNADNA酶切片段内切酶NC或尼龙膜NC膜或尼龙膜基因组DNA的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。Southertblotting用途（二）Northern印迹杂交利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称

4、为Northern印迹杂交（Northernblotting）。Northern印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。Northern印迹杂交的基本过程放射自显影照片相同点：Northern与Southernblotting的异同点转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法:DNA(碱变性）RNA（甲醛、乙二醛等）不同点原理均为毛细作用Northernblotting用途检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。

5、比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。（三）其他核酸杂交方法1.斑点印迹杂交2.原位杂交（insituhybridization）二、蛋白质印迹技术(Westernblotting)根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。因此，被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。Westernblotting应用检测样品中的特异蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的定量分析蛋白质分子的相互作用研究Hyp

6、oxia-++++++GTE-------EGCG-------CHX(10μg/mL)-015306090180(min)HIF-1αβ-actinHIF-1αβ-actinHypoxia-++++++GTE(40μg/mL)-++++++CHX(10μg/mL)-015306090180(min)HIF-1αβ-actinHypoxia-++++++EGCG(50μmol/L)-++++++CHX(10μg/mL)-015306090180(min)ABFig.1-1EffectsofGTEandEGCGont

7、hedegradationofhypoxia-inducedHIF-1αproteininHeLacells.ResultofWesternblotting.B)QuantitativedensitometricanalysisofresultsfromA.Westernblotting的应用Fig.1-1WesternblotanalysisofHIF-1αproteinlevels.Lane1:mocktransfectioncontrol;Lane2:pSG5emptyvectorcontrol;Lane3:

8、16E6;Lane4:16E7;Lane5:16E6mutant;Lane6:16E7mutant.HPV-16癌蛋白增强宫颈癌细胞HIF-1α的蛋白表达首先将混合蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。蛋白质印迹与DNA、RNA印迹相似之处电泳转移杂交放射自显影化学显色化学发