实验方法与步骤.doc

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1、2.2培养基的配制2.2.1PDA固体培养基（1L）取新鲜的马铃薯，在洗净、去皮后称取200g，切碎后放入装有800mL蒸馏水的1L的烧杯内。使用控温电热套加热、煮沸30min后，4层纱布过滤，收集滤液。最后，用电子天平称取20g蔗糖、15g琼脂粉，倒入收集到的滤液中，搅拌均匀后定容至1000mL。2.2.2Bavendamm氏反应培养基（1L）在1000mL的PDA固体培养基中，加入0.4mM鞣酸，并搅拌均匀。2.2.3氧化带测定培养基（1L）在1000mL的PDA固体培养基中，加入0.04%的愈创木酚，并搅拌均匀。2.2.4液体产酶培养基（1L）即PDA液

2、体培养基。取新鲜的马铃薯，在洗净、去皮后称取200g，切碎后放入装有800mL蒸馏水的1L的烧杯内。使用控温电热套加热、煮沸30min后，4层纱布过滤，收集滤液，并称取20g蔗糖（或葡萄糖），并搅拌均匀。最后，用量筒均匀地量取50ml的培养基，倒入150ml的三角瓶中。2.3实验方法2.3.1菌种的纯化和扩大培养从桂林南方食用菌研究所购买的15个平菇菌株，需要利用PDA固体培养基进行菌种的纯化以及扩大培养，才能够在实验过程中使用。在无菌操作台内，使用灭菌后的镊子，取菌种培养瓶内的平菇菌株，接种到事先配制好PDA固体培养基平板上，并放入28℃的恒温培养箱中。待平

3、菇菌株的菌丝长好后，再次转接到PDA平板上，28℃恒温培养8d，进行扩大培养。待菌丝长满整个平板后，即可用灭菌后的打孔器，将PDA平板上的菌种制成直径12mm、厚2mm的菌种塞，备用。2.3.2初筛用打孔器分别取1片纯化且培养好的直径12mm、厚2mm的菌丝，接种于装有Bavendamm氏反应培养基的平板中心，置于恒温培养箱中，28℃条件下恒温培养。最后，每天按时记录菌落周围是否产生棕色的轮环，有棕色轮环出现者记录为（+），无棕色轮环出现者则记录为（-），且用相机拍下平板上菌落周围的变化情况。若菌落周围有棕色轮环出现，则需使用刻度尺测量轮环的直径并做好记录。根

4、据菌落周围棕色轮环的直径大小，初步筛选出产漆酶能力较强的平菇菌株。2.3.3氧化带测定利用打孔器分别取1片纯化且培养好的直径12mm、厚2mm的菌丝，接种到装有氧化带测定培养基的平板中心，置于恒温培养箱中，28℃条件下恒温培养。每天按时记录菌落周围有无棕褐色氧化带产生，有棕褐色氧化带出现的记录为（+），无棕褐色氧化带出现者记录为（-），并有相机拍下平板上菌落周围的变化情况。如菌落周围有棕褐色氧化带出现，仍需使用可毒刺测量氧化带的直径并做好记录。根据菌落周围棕褐色氧化带的直径值大小，可以初步确定产漆酶高峰期较早的平菇菌株。2.3.4液体发酵培养使用打孔器分别取3

5、片纯化且培养好的直径12mm、厚2mm的菌丝，接种到装有液体产酶培养基的150mL的三角瓶中（一个菌种接种一个三角瓶），置于恒温培养箱中，28℃条件下静置培养。每隔3天测定一次培养基中的漆酶活性，并记录实验数据。2.3.5漆酶活性的测定此次实验漆酶活性的测定使用的是愈创木酚法。10mL的反应体系为：1mL95%乙醇溶液（溶有0.04mmoL的愈创木酚）+1mL粗酶液+8mL琥珀酸钠缓冲液（50mmol，PH为4.5）。具体的实验操作如下：用1000μL的移液枪于无菌超净操作台内，分别取3mL（1mL=1000μL）的酶液，经高速离心机（R=4500转/秒，t=

6、10min）离心后，分别取1mL的上清液装入10mL的离心管内，用作实验和空白对照中的粗酶液。第一步，将用作空白对照的装有1mL粗酶液的离心管，放入沸水浴中2—5min，进行酶液的灭活操作。第二步，按照10mL的反应体系，将乙醇溶液和琥珀酸钠缓冲液依次加入各个装有粗酶液的离心管中。30℃条件下，恒温水浴30min后，以灭活后的粗酶液反应混合液做空白对照，在465nm处测量各个酶液的吸光光度值（即OD值），并作好实验数据的记录。第三步，计算漆酶活性。漆酶活性的计算公式为：酶活（U/mL）=1.0*106*V总*△A/（V酶*ε*△t），其中V总、V酶分别代表反应

7、体系的总体积及反应酶液的体积，ε为吸光系数（愈创木酚的ε465=1.21×104mol－1·L·cm-1）。注意事项：（1）50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（PH=4.5）的制备方法：用电子天平称取1g的NaOH固体、5.9g的琥珀酸固体，溶于装有800mL蒸馏水的烧杯中。搅拌均匀后，用0.5mmol/L的NaOH溶液调节PH至4.5（用PH计测量），最后定容至1000mL；（2）漆酶酶活单位的定义：在1min时间内，催化氧化1nmol愈创木酚的酶量作为1个酶活单位（U）。