合成肽与载体蛋白的连接课件.ppt

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时间:2020-09-07

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1、合成肽与载体蛋白的连接引言合成肽可以作为半抗原,与蛋白载体连接后能有效地诱导机体产生免疫应答。近年来合成肽在免疫学中的应用倍受重视,特别是在抗肽抗体的制备以及T细胞和B细胞表位分析中的作用。载体蛋白的选择:除应具有较好的免疫原性外,还应具有足够的反应侧链氨基酸残基,以便与合成肽连接。连接方式的选择:大多数连接方法依赖于游离的氨基(Lys)、巯基(Cys)、酚基(Tyr)、羧基(Asp或Glu)的存在。选择连接的方法是肽与载体通过C-或N-末端残基连接。相应于蛋白质氨基端的肽通过其羧基末端氨基酸残基连接,而相应于蛋白质羧基

2、端的肽通过其氨基末端氨基酸的残基连接。四种方法MBS连接法戊二醛偶连法EDCI法BDB连接法MBS连接法MBS是目前已知的最好的异双功能交联剂,在中性PH环境,将巯基与氨基交联。第一步反应是通过载体蛋白与MBS连接,形成MBS/KLH连结物。层析纯化后,MBS/KLH与含Cys的合成肽交联。反应过程中,合成肽Cys残基只提供巯基组,载体蛋白N-端和Lys侧链提供氨基组。试用范围:合成肽必须具有游离的-SH,二硫键不宜用此法连接。操作步骤:1、将5mgKLH溶于0.5mlPBS中,置透析袋内,于4℃用PBS透析过夜后,转入

3、玻璃试管内。2、加入MBS/DMF70ul,室温搅拌30min。3、取经PB预平衡的PD-10层析柱,缓慢加样,PB洗脱,大约收集12-20管,每管0.5ml,确定收集峰(MBS/KLH结合物)。4、将10mg合成肽溶于PBS中,如果合成肽不溶于PBS,则可溶于含6mol盐酸胍的0.1mol/LPB中。5、将合成肽溶液与MBS/KLH结合物混合,以0.1mol/LHCL或0.1mol/LNaOH调节至pH7.3,室温孵育3h,置4℃蒸馏水中透析过夜,换一次蒸馏水后继续透析大于或等于4h,连接物置于4℃保存供一次试验用,或

4、-20℃保存备用。凝胶层析凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。可以将样品中的大分子物质和小分子物质分开。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。戊二醛偶连法戊二醛也是异双功能偶连剂,它的两个醛基可分别与合成肽或半抗原和载体的氨基以共价键结合,将合成肽或半抗原与载体连接在一起,最好是在肽的适当部

5、位含有Lys残基。首先将KLH与肽结合,然后应用戊二醛法交联,以甘油封闭未参与反应的戊二醛的作用。EDCI法EDCI是一种化学性质很活泼的双功能试剂,其偶连反应既可在氨基部位,也可发生在羧基部位,将肽C-端羧基与载体游离的氨基,即Lys侧链连接。因此,含有内部Asp,Glu或Lys残基的肽不宜用此法。第一步是肽与EDCI连接,将10mg合成肽溶于1mL双蒸水中,在磁力搅拌下加入EDCI40mg,用0.1mol/LHCl调节至pH4.5,室温反应5~10min;然后加入双蒸水溶解的KLH10mg/0.5mL,室温作用2h后

6、,4℃透析过夜,冰箱保存均同上。实验所用EDCI应新鲜配置。为了避免肽聚合的形成,含有磷酸盐,碳酸盐或氨基的缓冲液因影响其反应,应避免应用。BDB连接法BDB原是将肽Tyr侧链与载体蛋白Tyr侧链连接,但是通过与His,Cys和Lys侧链相互作用也可连接。如果没有这些残基,在合成肽时,可在肽的C-端或N-端加入一个Tys残基作为连接位点。首先将合成肽与KLH混合,然后用BDB交联,即将5mg联苯胺-HCl溶于1mL0.2mol/L中,4℃条件下变振荡边加入NaNO2,4℃避光振荡避光振荡1h,该溶液可在-70℃保存一年,

7、将KLH5mg溶于10mLpH9.0硼酸缓冲液中,加入合成肽2mg,置冰浴冷却;缓慢滴加0.1mLBDB,置4℃振荡2h,以0.1mol/NaOH调节至pH9.0,倒转试管数次,低温冰箱保存备用。本法有时形成不溶性连接物,混匀后即可使用。适当减少BDB与肽/蛋白载体的反应时间可避免不溶性连接物的形成。苯、BDB有致癌作用,应避免与皮肤直接接触!

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