《基因与载体连接》PPT课件

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1、第六章基因与载体连接一、黏性末端与平末端的连接二、其他连接方法一、黏性末端与平末端的连接一）黏性末端DNA分子间的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。1.两段DNA的连接依靠粘性末端依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接nickligase3.4.粘性末端的更换在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口二)平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-O

2、H-PP-HO-5’3’1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚物加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点5‘突出的末端　外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。5‘3‘3‘5‘5‘3‘3‘5‘外源基因载体TdTployCTdTp

3、loyGKlenow补3‘平端5‘5‘5‘5‘CCCCCCCCCCGGGGGGGGGG退火用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。

4、5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接

5、在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键的自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5

6、’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。一）PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点(MCS)；（1）设计原则避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。二、其他连接方式（2）带酶切位点的引物结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5

7、’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’GCTAGCCGGPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’GCT