实时荧光定量PCR技术的原理及应用,注意事项,适合菜鸟入门课件.ppt

《实时荧光定量PCR技术的原理及应用,注意事项,适合菜鸟入门课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、汇报人：朱林林2011/03/25实时荧光定量PCR技术目录实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR的实验设计实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较实时荧光定量PCR误差分析及操作规范实验中污染的防控荧光定量PCR报告模板实时荧光定量PCR基本原理常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板进行定量分析。常规vs实时优缺点比较定量PCR三个基本概念(1)扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。定量PCR三个基本概念(2)阈值的概

2、念在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。定量PCR三个基本概念(3)CT值PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210荧光定量PCR的定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量。荧光定量PCR的化学原理化学方法分类非特异性SYBRGreenI法特异性

3、TaqMan探针法SYBRGreenI法原理：结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计成本较低缺点与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化灵敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI法溶解曲线分析荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析；(3)、SYBRGreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定

4、量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStarTaq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；(4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；(5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。(6)、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。TaqMan探针法水解型报告基团，淬灭基团FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐TaqMan作用机理两种

5、化学的比较实时荧光定量PCR的实验设计绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值定量PCR--相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题样品材料不均一造成的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样

6、本间加样量不同带来的误差实时荧光定量PCR两种相对定量方法比较相对标准曲线法和2-ΔΔc(t)法相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低2-ΔΔc(t)法前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT

7、（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：2–ΔΔCT=表达量的比值当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比一般步骤选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法RT-PCR反应数据获得及处理目标基因C(