实时荧光定量PCR原理及应用ppt课件.ppt

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1、实时荧光定量PCR原理及应用上海吉泰生物科技有限公司张达威主要内容荧光定量PCR原理荧光定量PCR方法与应用荧光定量PCR定义在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量。传统PCR定量与实时定量PCR传统的PCR定量是一种终点法的检测：动态范围受限检测重现性极差实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测：灵敏度高重复性好动态范围宽高通量Gel-basedquantification11,500counts/5200counts=2.2folddifferenceReal-timequanti

2、ficationCt18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifferenceCt终点检测重复性好精确度高误差小传统PCR与实时定量PCR阈值threshold：在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT=cyclethreshold即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。阈值与CT值检测极限[DNA]CycleCtCtCt阈值thresholdC(t)值与阈值荧光定量PCR原理起始模板浓度的对数与C(t)值成

3、反比如何定量绘制标准曲线所测样本C(t)值定量标准曲线通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计算出样品中所含的模板量荧光定量PCR方法荧光染料法荧光探针法SYBRGreenI™TaqMan®MolecularBeaconsDNAbindingProbebaseddetectionTaqTaq染料和探针SYBRGreen:最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍不能区分引物二聚体

4、，单链二级结构，非特异性产物需要做熔解曲线分析产物的单一性SYBRgreen是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势，在试验验证和问题分析上非常有用。SYBRGreen法作用机理熔解曲线分析单一峰，无非特异性产物，定量准确有杂峰，有非特异性产物，定量不准确unboundprobefreeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特点：特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测完全实时监

5、测：一分子荧光信号对应一条DNA链的产生多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列Taqman探针法Taqman探针：是与目的序列互补的寡聚核苷酸，5‘端标记荧光报告集团，3’端标记荧光淬灭集团，探针完整时不发出荧光，水解后发出荧光。HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道实验DanielCandotti-Cambridge,UK绝对定量相对定量SNP分析实时定量PCR应用应用之一：病

6、原体检测与定量绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数－病原体的多少）标准品（如质粒）：做系列梯度稀释待测样本阴性对照（NTC）应用之一：病原体检测与定量1432应用之一：病原体检测与定量应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织）与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因Normalizer看家基因应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCtCt1Ct2应用之二：基因表达差异分析基因表达差异＝

7、2/2Ct1Ct2＝2Ct1-Ct2应用之二：基因表达差异分析RNA抽提RT定量PCRcDNA产物系列稀释两个基因的扩增效率应用之二：基因表达差异分析1234应用之二：基因表达差异分析两条探针分别针对不同等位基因ACGTACGT应用之三：SNP分析应用之三：SNP分析FAMTETFAMTET12应用之三：SNP分析21Thankyou！选择吉泰，选择成功！试验设计与优化PCR是精确性很高的实验，实验前我们需要完整的实验设计方案，而且实验条件对结果影响也很大。PCR扩增效率：保证实验的精确性和重复性。影响扩增效率的因素：扩增子长度；扩增子G

8、C含量；扩增子、引物、探针二级结构；PCR各组分反应浓度；模板浓度。引物设计原则扩增片段100-200bp引物长度18-30bp，Tm在