荧光定量PCR技术与常见问题分析ppt课件.ppt

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1、荧光定量PCR技术与常见问题分析汪瑾生命科学实验中心2012.09.26定量PCR是如何工作的荧光定量PCR是什么一种实时监控目的基因PCR扩增的技术定量PCR是如何工作的?传统PCR具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAAC

2、CGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:>双链DNA模板变性>引物与模板退火>引物延伸?新的扩增片段定量PCR是如何工作的?理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍在PCR混合液中含有荧光物质。定量PCR是如何工作的?无论哪个型号，所有的荧光定量PCR仪都有三个共同的组成部分定量PCR是如何工作的?PCRPCRLotsofPCRPCRproduct随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加定量PCR是如何工作的?Real-ti

3、mePCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:为什么要用定量PCR？重复性好灵敏度高动力学范围宽一个好的定量PCR数据1:重复性好2:灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因3:动态范围宽兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围(越大越好)为什么要用定量PCR？快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。为什么要用定量PCR？安全：不用EB或放射性物质定量PCR的化学原理支持的化学试剂SYBR®GreenITaqMan®TaqMan®中会使用到两段短片段序

4、列，称为双向特异引物TaqMan®化学原理第三段短片段序列，又称为探针,位于序列中间TaqMan®化学原理报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye探针标记两种染料分子TaqMan®化学原理Reporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)完整的探针TaqMan®化学原理光能然而，如果探针断裂了……TaqMan®化学原理Denaturation变性(95ºC)TaqMan®化学原理Annealing退火(60ºC)TaqMan®化学原理Taq酶登场……TaqMan®化学原理找到引物序列……TaqMan®

5、化学原理开始延伸(60ºC)TaqMan®化学原理Extension延伸(60ºC)TaqMan®化学原理Extension延伸(60ºC)TaqMan®化学原理?Extension延伸(60ºC)TaqMan®化学原理Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针Ta

6、qMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理Taq酶降解探针TaqMan®化学原理TaqMan®化学原理TaqMan®化学原理TaqMan®化学原理TaqMan®化学原理嗝!TaqMan®化学原理SYBR®GreenI化学原理SYBR®GreenI

7、染料SYBR®GreenI染料SYBR®GreenI染料SYBR®GreenI染料的缺点非特异结合任意双链DNA定量结果不准确非特异性PCR产物信号使用熔解曲线Meltcurve(DissociationCurve)检查反应特异性TemperatureFluorescenceMeltcurve:导数图谱一个干净的峰=没有无关的产物TemperatureFluorescenceMeltcurve的杂峰可能是引物二聚体多余的峰是如何产生的?非特异扩增1、转录组中错误的目的基因。2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组D

8、NA又检测cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高的Tm值)。解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点引物二聚体到底用哪一种化学方法呢？TaqMan®,还是SYBR®Green?...TaqMan®,还是...SYBR®GreenI?优点更高的特异性不会有引物二聚体干扰支持多重荧光实验设计实验方法易于优化