感受态细胞制备.doc

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1、感受态细胞制备一、实验目的1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。二、实验原理在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取

2、对数生长期的细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1x108转化子每1μgDNA，甚至1x109转化子每1μgDNA，所以常用于文库构

3、建时的转化或遗传筛选化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。物理制备法：电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/μg闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：　　转化总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化率（转化子数／每μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(μ

4、g)理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为1*1010三、实验材料实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培养基、实验试剂：0.1MCaCl2溶液、含10%甘油的0.1MCaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。三、实验步骤（一）化学感受态细胞的制备（1）菌种的活化：取-70℃的冰箱中感受态细胞DH5α、Top10、DE3、BL21在LB的平板上进行划线分离。（2）菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于10mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数

5、生长中后期。（3）菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100的比例分别接种于四个不含有抗生100mlLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。（4）感受态细胞的制备：①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100mL培养液均匀分成两份到50mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。②弃去上清液，加入30mL0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min。③弃去上清液，加入30mL0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min。④从冰水中取出4℃、3000转每分钟，离心10min，弃去上清

6、液并用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净，加入0.5mL含10%甘油的0.1MCaCl2溶液。用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好0.5ml离心管，用剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装40μL悬浮液。⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。（二）电转化的感受态细胞的制备第1、2、3步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3三步相同。（4）制备感受态细：①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100mL培养液均匀分成两份到50mL离心管中，在4℃

7、、3000转每分钟，离心10min。②弃去上清液，加入30mL三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉淀充分混匀，在4℃、3000转每分钟下离心10min，倒去上清。重复两次；③再加入30mL含10%甘油水溶液，在4℃、3000转每分钟下离心10min，重复一次。④弃去上清液，加入0.5mLGYTmedium(含有10%Glysiron、0.125%YeastExtraction、0.25%Trypton)，放置在冰上。（5）准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5mL离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感