荧光定量PCR原理应用及StratageneMx3000P介绍-PPT课件.ppt

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1、实时荧光定量PCR原理及应用上海吉泰生物科技有限公司裴杰萍内容提纲荧光定量PCR原理及应用StratageneMx3000P荧光定量PCR仪常规核酸定量方法Southern杂交Northern杂交原位杂交传统RT-PCR半定量PCR存在的问题灵敏度准确性特异性时间实时荧光定量PCR定义利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控目的对起始模板进行定量优点灵敏,重复性,动态范围宽,高通量原理C(t)值与起始模板浓度的对数成反比什么是C(t)值C(t)Threshold（域值）C(t)值与起始模板的关系为什么要引入C(t)值CtEndpoints96replicatesofB7g

2、enemolecularbeacon利用电泳定量11,500counts/5200counts=2.2folddifference实时荧光定量Ct18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifference如何定量标准曲线未知样品的C(t)值定量常用的荧光试剂SYBRGreenITMTaqMan®/TaqMan-MGB®MolecularBeaconsMGBEclipseTMProbesLux®primersScorpionsTMAmplifluorQ-ZymeOthers...dsDNADetectionTarget-specificDetections

3、sDNA=freedye(weakfluorophore)dsDNA=Bindsminorgroove(intensefluorophore)SYBRGreenI(双链DNA结合染料)SYBRGreenI™DetectionTaqMan®探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式散失Donordye(Reporter)Acceptordye(Quencher)LightEnergytransferTaqTaq水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离TaqLightEmissionLightHCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHI

4、V-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道实验DanielCandotti-Cambridge,UK荧光定量PCR应用特异核酸（基因）定性、定量RNA(cDNA)基因表达差异分析基因芯片结果验证DNA病原体定性与定量GMO(遗传改良组织)检测序列特异性等位基因分型,SNP检测应用之一：病原体检测与定量绝对定量（特异基因的拷贝数－病原体的多少）标准品（如质粒）：梯度稀释未知样品阴性对照（NTC）应用之一：病原体检测与定量1432应用之一：病原体检测与定量应用之二：基因表达差异分析相对定量：

5、基因表达量上升或者表达被抑止的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织）与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因Normalizer看家基因应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCtCt1Ct2应用之二：基因表达差异分析基因表达差异＝2/2Ct1Ct2＝2Ct1-Ct2Xn＝X0(1+E)n应用之二：基因表达差异分析RNA抽提RT定量PCRcDNA产物系列稀释两个基因的扩增效率应用之二：基因表达差异分析4folddown3foldup应用之二：基因表达差异分析两条探针分

6、别针对不同等位基因ACGTACGT应用之三：SNP分析应用之三：SNP分析FAMTETFAMTET应用之三：SNP分析应用之四：GMO检测目的：检测食品等中转基因成分的含量大量的作物被遗传改良来获得一些性状，如：抗除草剂，抗虫，抗病等应用之四：GMO检测抗除草剂的转基因大豆广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。草甘膦是EPSPS（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下，EPSPS的活性被抑制。植物被转化了一种耐受草甘膦的EPSPS基因，获得抗性。检测策略抗性EPSPS基因的量转基因大豆的量Lectin基因的量食品中大豆总量应用之四：GMO检测数

7、据处理：C（t）EPSPS-C（t）Lectin＝△C（t）%GMO＝（1+E）Ct荧光定量PCR仪的硬件条件激发光源热循环－加热、制冷样品检测设备荧光定量PCR仪应满足的要求光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料能分开不同荧光素的激发光与发射光波长能检测的灵敏度与动态检测范围准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.荧光定量PCR原理及应用StratageneMx3000P荧光定量PCR仪Stratagene’sNewMx3000P!HighPerformancePersonalPriceStratagene公司