酶的生物改造.pptx

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1、酶的生物改造——酶的定向进化研究进展介绍提纲定向进化技术概述定向进化技术的应用定向进化的方法1、酶分子改造的方法基于序列的理性设计：化学修饰和定点突变利用已知酶分子的特征、空间结构、结构和功能之间关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造；利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并定向筛选出所需突变酶；一、定向进化概述实例：木糖异构酶的定点突变改造实例：木糖异构酶的定点突变改造突变前蛋白与木糖复合物模型突变后蛋白与木糖复合物模型氨基酸残基与木糖之间

2、距离比突变前下降，不利于体积更大的葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提高2、生物自然进化的局限性自然进化过程：突变→自然选择→遗传后代自然进化结果：生物多样性基因多样性：为完成同一功能所表现出的多个基因或同一个基因（同源性）局限性：周期长，效率低；可控性差；基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成为可能，在几天和数月内即可完成；还可以让人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至可以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适应大工业生产的需要。---哲理上,承认了人类对蛋白质的认知的严重不足;---技术上,将大自然已经实践了几亿年的达尔文进化原理应用于试管

3、中,以随机突变与随机杂交方法来改变蛋白质的性能,再辅以筛选来获得优异的变种。(FrancesArnold,Caltech,1993)3、酶的定向进化技术定义：从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望具有某些特性的进化酶；所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。4、定向进化的原理在待进化酶基因

4、的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的蛋白质稳定性活性有机溶液中的活性不同的底物的利用酸碱度蛋白质的表达亲和性专一性1234……性能代数达到目的随机突变随机杂交

5、筛选目标蛋白酶定向进化的过程和应用范围二、酶定向进化的应用酶定向进化的典型例子枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化β－内酰胺酶的活性提高了32,000倍；β－半乳糖苷酶的底物特异性提高了1000倍，且活性提高66倍；天冬氨酸转氨酶对β－支链氧代氨基酸活性提高105倍且对缬氨酸的催化效率提高2.1×106倍等。定向进化的成功例子成功的例子Reetz等(1997)将脂酶水解对硝基-2-甲基癸酯的对映体选择性提高了40倍You和Arnold(1996)提高了枯草杆菌蛋白酶E的表达水平和在有机溶剂中的活性，使酶的总活力提高了500倍Zhao和Arnold（1

6、998）在保持酶活力不变的条件下将枯草杆菌蛋白酶E的作用温度提高了17度三、酶定向进化的基本过程随机突变不同的定向进化方法构建突变基因文库载体的选择，基因重组，组建基因文库突变基因的筛选平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法1、定向进化的方法无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变有性进化方法1）DNA改组法（DNAShuffling)2）体外随机重组法（RPR)3）交错延伸法(StEP)基因家族的同源重组外显子的改组杂合进化无性进化：易错PCR方法无性进化：易错PCR方法方法：向单一酶分子基因内随机引入突变(在PCR扩增过程中调整反应条件），制造突变酶库

7、以便筛选；特点：遗传变化仅发生在单一分子内部，属于无性进化改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至5％-10％）,加入dITP来代替被减少的dNTP.缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）；添加一定浓度的锰离子；易错PCR方法实例1993年，ChenandArnold在非水相DMF中，定向进化枯草杆菌蛋白酶E活力获得成功，在60％和85％的DMF中，活力分别提高256和131倍；优点：操作简便，随机突变丰富；缺点：正突变概率低，突变基因文库较大，文库筛选工作量大；适用范围：适用

8、于较小基因的定向进化有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)有性进化：DNA改组方法方法：从正突变基因库中分离