低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和no分泌的影响的论文

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1、低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和NO分泌的影响的论文作者：马彦卓，许旭东，韩凯，李飞，曹艳杰，张荣庆,王海昌【摘要】目的：观察不同作用时间下低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（epcs）增殖活性和no分泌的影响.方法：密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,培养4d后收集贴壁细胞，每日给予低频脉冲电磁场干预，磁场强度0.6mt，频率15hz.按作用时间的不同分为对照组（0h）和磁场作用时间组(0.5，2，4，8h组)，各组细胞培养及磁场干预3d后,分别采用mtt比色法测定epcs的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期，griess法检测培养上清中no水平.结果：对照组a490n

2、m为（0.37±0.07）,0.5h组（0.37±0.06）,2h组（0.40±0.09）与对照组（0.37±0.07）相比差异无统计学意义(p>0.05）；4h组a490nm值开始增加［(0.45±0.03）vs（0.37±0.07）;p<0.05］,8h组较对照组增加最为明显［（0.49±0.08）vs（0.37±0.07）；p<0.01］.0.5h组，2h组细胞增殖指数pi（s+g2m）％与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05），4h组，8h组细胞增殖指数与对照组相比差异均有统计学意义（p<0.05）.no分泌随磁场作用时间的延长，其分泌增加.结论：低

3、频脉冲电磁场可影响epcs的增殖及no分泌，随着作用时间的延长，细胞增殖及no分泌增加.【关键词】电磁场;内皮祖细胞;细胞增殖；一氧化氮　　0引言　　内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，epcs)作为治疗性血管形成的研究靶点，已发现其不仅参与血管形成，也参与出生后血管生成［1］.低频脉冲电磁场作为一种外来干预手段，已发现其可促进内皮细胞修复，促进内皮细胞fgf的分泌，提示低频电磁场对血管形成具有促进作用［2］.我们采用体外培养大鼠骨髓epcs,观察低频脉冲电磁场不同作用时间下骨髓epcs增殖能力和no分泌的变化及其时效关系,并探讨其相关作用机制，以期寻找一种新的

4、促进血管生成的手段.　　1材料和方法　　1.1材料健康雄性sd大鼠30只，体质量80～100g（第四军医大学实验动物中心）；脉冲电磁场发生仪（第四军医大学生物医学工程系）；ficoll淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程医学研究所）；胎牛血清（美国hyclone公司）；血管内皮生长因子(vegf)，成纤维细胞生长因子（bfgf）（澳大利亚cytolab公司）；fitc标记荆豆凝集素ⅰ(fitcueai，美国sigma公司）；dii标记的乙酰化低密度脂蛋白(diiacldl，美国molecularprobe公司）；no试剂盒（南京建成生物工程研究所）；激光共聚焦显微镜（美国biora

5、d公司）.　　1.2方法　　1.2.1epcs的分离、培养与鉴定［2-3］将大鼠颈椎脱臼处死后,取四肢骨用750ml/l乙醇浸泡10min，用5ml注射器抽取培养液冲洗骨髓液,密度梯度离心法获取单个核细胞,将其接种予培养瓶中,在m199培养基(含100ml/lfbs，vegf10μg/l，bfgf5μg/l，l谷氨酰胺300mg/l，青霉素1×105u/l，链霉素100mg/l，肝素1.25×104u/l)中培养,差异贴壁法培养4h后，吸取上清置于新的培养瓶中继续培养4d.将培养4d的细胞消化，接种于盖玻片上，24h后将细胞爬片行dilacldl与fitcueai直接免疫荧光双染.

6、向细胞爬片孔内加10mg/ldilacldl，37℃孵育10h后，细胞爬片经40g/l多聚甲醛室温固定10min，pbs漂洗后加入10mg/lfitcueai并于37℃避光孵育1h，pbs洗涤同上，晾干后封片，激光共聚焦显微镜观察.fitcuea和diiacldl双染色阳性细胞为正在分化的epcs.　　1.2.2实验分组pemfs发生仪频率15hz,磁感应强度:0～1.4mt可调，线圈直径200mm.调整两线圈距离至100mm.将线圈放置在孵箱中,刺激时将细胞放置在两线圈中间位置.调整需要的强度和频率,实验分组按磁场强度分为对照组（不加磁场干预），0.2mt,0.6mt和1.0

7、mt各组,贴壁细胞消化后,每组按每日干预时间的不同随机分成0.5，2，4，8h各亚组.即每日各组分别干预0.5，2，4和8h，共3d.　　1.2.3细胞活性检测如上述方法收集贴壁细胞并计数.将等量epcs接种到96孔培养板上,磁场干预3d后，每孔加5g/lmtt20μl,培养4h后小心吸弃上清液,每孔加入dmso150μl,于微量振荡器充分振荡10min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪上测a490nm,以空