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1、僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究论文.freelentationandfractionseparatedbygelfiltrationchromatographyofBombyxBatryticatus.MethodsAnticoagulatingactivefractionsethodsofentationandgelfiltrationchromatography.ponents(suchasporteinsorpolypeptide,.freelinoacids,oxalicacidammonium)ineachfr
2、actioninedbychemicalreactionindentification,Kjeldahlmethod,conductance,UVandHPLC.ResultsPolypeptide,aminoacidsandoxalicacidammoniumainponentsinanticoagulatingactivefractions,contentoforethan80%.Thecontentofoxalicacidammoniumdecreasedabout52%processedbyalcoholsedimen
3、tation,inoacidsonlydecreasedabout8%.Thecontentofpeptidesandaminoacidsincreasedabout28%purifiedbygelfiltrationchromatographyparedentation.Thecontentofoxalicacidammoniumeastheoneinalcoholsedimentation,butdecreasedabout1timeparedinoacidsakedupto60%～76%ofthecontentofpro
4、teinsdeterminedbyKjeldahlmethod.MolecularentalbasisforfurtherseparationandpurificationofanticoagulatingactiveponentsfromBombyxBatryticatus.KeybyxBatryticatus；anticoagulatingactivefractions；chemicalponents；gelfiltrationchromatography；HPLC；Kjeldahlmethod僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bomb
5、yxmoriL.4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌而致死的干燥体,为传统中药,性味咸、辛、平,归肝、肺、胃经1。具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效,可用于治疗急性惊风、癫痫、中风、面瘫及顽固性头痛等。僵蚕含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵菌素以及微量元素等成分2-4,其水提液在体内外实验中均表现出很强的抗凝、抗血栓、促纤溶及抗内毒素所致红细胞膜损伤等作用5-7,草酸铵和蛋白质(或多肽)、氨基酸等可能为其主要活性成分8。为进一步研究僵蚕的抗凝活性成分,本实验探讨了僵蚕水煎煮液的醇沉液和凝胶色谱分离净化,及其抗凝活性成
6、分中氨基酸和草酸铵等的定性定量分析,现报道如下。1实验材料ETTERTOLEDO公司)；DDS-ⅡA电导率仪(上海理达仪器厂)；移液枪(0.1mL和1.0mL,日本)；半微量凯氏定氮装置；Z-16和Z-26层析柱(上海化学仪器厂)。制僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司)；葡聚糖凝胶(Biotech公司)；凝血酶试剂(上海太阳生物技术公司,批号N25006)；兔血浆(自制)；15种氨基酸对照品(Sigma公司)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(THF)、2-巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等化学
7、试剂均为分析纯。2方法与结果2.1样品溶液的制备称取制僵蚕1500g(样品A),用8倍量水浸泡过夜,以3000r/min匀浆,然后煎煮2次,每次30min,过滤,合并滤液,离心,得提取液8450mL(样品B),将其浓缩至含原药材2g/mL,加无水乙醇浓度至60%,4℃放置过夜,3000r/min离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约6g/mL,即得粗提液240mL(样品C)。将30mL该液加到用0.05mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.4)缓冲液平衡的SephadexG-25凝胶柱(φ2.6cm×80
8、cm)上,用相同缓冲液洗脱,自动分步收集器收集,2.5mL/(10min·管),每2～3管按文献方法8测定凝血酶时间(TT,s)、紫外吸收光谱,用重量法测定质量百分浓度(m/v)、电导率仪测定溶液电导率,得洗脱曲线(见图1)。将TT在40～100s之间的组分合并得洗脱液69m
