荧光定量pcr技术在临床肺结核防治中的应用论文

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1、荧光定量PCR技术在临床肺结核防治中的应用论文【摘要】目的建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法，评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法。分别以荧光定量PCR、集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊病人随访的痰标本，比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果荧光定量PCR的检测灵敏度为4Copies/反应，远高于抗酸染色法和集菌培养法。荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64.29％、

2、35.12％和12.5％。病人治疗效果的随访检测结果显示，结核分枝杆菌的数量呈持续减少的趋势。结论荧光定量PCR方法具有快速、敏感和特异性高的特点，可以快速、及时获取病人服药后的治疗效果，为医生的后续督导治疗提供依据.freelePCRintheclinicaldiagnosisandefficiencyevaluationoftreatmenttolungtuberculosis.MethodReal-timePCRePCRduringclinicaltreatmenttothepatientsePCRismor

3、esensitiveandpositiverate(64.29%)inishedobviouslyinthetreatmentfolloePCRhashighsensitivityandspecificityinthedetectionofM.tuberculosis.Themethodcouldfeedbacktheefficiencyandprovidessensibleadvicefortreatmentintime.【KeytuberculosisReal-timePCRGenediagnosisEffic

4、iencyevaluationoftreatment目前结核病仍是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人2000多万，其中95％在发展中国家，我国是22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第二位，每年因结核病死亡的人数达到15万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会的发展1～3。结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据。提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和染色镜检法为主要的实验室检测手段。大量研究表明，传统方

5、法的检出率低、培养周期长，难以满足临床需要。荧光定量PCR是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术，具有灵敏度高、特异性好、可定量、污染少、易于标准化等优点，得到了广泛的应用4，5。本研究建立了荧光定量PCR检测临床结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量PCR在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进行了评价，现将结果报告如下。1材料与方法1.1标本1.1.1疑似病人采集2009～2010年5月到深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者的痰液标本168份，其中男性115份，女性53份，年龄15～60岁。1.1.2确诊患者选择临床确诊

6、肺结核病人，有低热、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺结核表现，X线健康检查肺部有结核病灶，实验室检测结果为阳性。为确保样本采集的连贯性，在争取病人同意随访的同时，选择暂时在家休养的就近病人。跟踪随访采集深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者漱口后痰液，选取3例活动性肺结核患者，采集病人服药前1天的晨痰，随访中1～7日内每天采集1次，后续间隔2～5天采集1次。1.2仪器Bact/Alert3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、Heraeus低温冷冻离心机Megafuge1.0R、Biospec-miniDNA/R

7、NA/Proteinanalyzer（岛津）、7500荧光定量PCR扩增仪（AppliedBiosystems）、凝胶成像系统（英国UVItec）。1.3抗酸染色法与集菌培养法操作参考《结核病诊断细菌学检验规程》6进行。1.4痰液DNA的提取取0.5ml痰标本加入2倍样本体积4％的NaOH，液化10min后15000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml灭菌水，充分振荡混匀，15000r/min离心2min，去上清液，重复洗涤3次；沉淀中加入50μlDNA提取液（1％NP-40+2％TritonX

8、-100）4，充分振荡混匀，100℃水浴10min；待冷却至室温，15000r/min离心5min，取上清液备用。1.5荧光定量PCR方法7～101.5.1引物与探针设计针对IS6110基因设计引物与探针，上游引物：5’-GTCGCCCGTCTACTTAATG-3’，下游引物：5’-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3’，产物长度为107bp。探针：5’