镧系离子时间分辨荧光检测法在核酸分析技术中的应用

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1、镧系离子时间分辨荧光检测法在核酸分析技术中的应用游冬青陈杞〔第二军医大学，上海，200433)摘要本文综述了镧系离子时间分辨荧光技术在核酸分折领域中的应用概况，介绍了DELFIA系统、FIAgen系统和EALL系统的使用特点，包括时间分辨荧光分析原理、镧系离子标记DNA探针和运用时间分辨荧光技术检测PCR产物的技术和方法．镧系离子时间分辨荧光(TRF)分析技术是一种新颖的非放射性标记技术。该技术在核酸的定量定性分析中已得到广泛的应用。在检．测的特异性、灵敏度、测量速度以及标记物的稳定性方面都显示出一定的优越性。目前国内

2、外将时间分辨荧光法应用于核酸分析领域中主要包括两个方面，—是应用镧系离子标记的DNA探针技术进行杂交分析，二是将镧系离子标记技术引入PCR中，使PCR产物鉴定简便易行。本文简述该方法的应用及发展前景。1时间分辨荧光分析法原理在时间分辨荧光分析中使用的示踪剂是镧系离子如铕离子(Eu3+)、铽离子(Tb3+)、镝离子(Dy3+)。与传统的荧光标记物相比，镧系离子的标记物具有斯托克斯位移大、荧光寿命长、发射波长较窄等特点，有利于降低本底和提高分析的灵敏度。目前应用于时间分辨荧光法的分析技术主要有三种类型(表1)，即DElFI

3、A系统（WALLAC公司)、FIAgen系统(Cy-berFluor公司)和EALL系统。DELFIA系统的特点为形成Eu3+(NTA)3(TOPO)3型的荧光复合物，其中NTA为2—萘酰三氟丙酮，TOPO为三辛基氧化磷。Eu3+—螯合剂(聚羧酸型)标记的探针与靶DNA杂交后洗涤，低pH条件下,Eu3+可释放出来与增强液中的NTA与TOPO结合形成最终的荧光复合物。在DNA分析中，该系统检测的灵敏度为10-18~10-16mol量的DNA探针。FIAgen系统所用的铕离子螯合剂为4．7—二氯磺基苯—1，l0—邻二氨杂菲

4、—2，9—二羧酸(BCPDA)做标记物与Eu3+螯合后团相测量，避免了外源性Eu3+的污染。该系统应用在生物素探针与BCPDA标记的链亲和素(SA)结合方面可取得满意的检测结果。常见的标记SA所形成的复合物有三种，一为BCPDA直接标记SA形成复合物SA(BCPDA)，检测灵敏度为10-10~10-11mol／L；二为SA与标记有160个BCPDA的甲状腺球蛋白(TG)相连形成一个大分子的复合物SA〔TG〕(BCPDA)160检测灵敏度10-11~10-12mol/L；三为活化的SA〔TG〕(ECPDA)160复合物非

5、共价连上两个BCPDA—TG形成一个大分子复合构(SBMC)，检测灵敏度为10-12~10-18mol/L。EALI系统为酶促放大镧系荧光系统，是以碱性磷酸酶为标记物，底物为5—氟水杨酸磷酸酯(5—FASP)，底物水解后所生成的5—FSA，在高PH条件下可与Tb—EDTA形成高强度的荧光复合物，即可进行时间分辨荧光测定。应用时间分辨荧光法进行核酸杂交分析有两种不同的形式，一种为斑点印边杂交或在微孔条中进行杂交分析。样本核酸不必经过电泳，直接点样到滤膜或微孔中进行杂交。常用DEFLIA系统进行检测，引入杂交体系中的Eu3

6、+需释放出来，与加入的增强液形成荧光复合物方可进行检测。另一种类型为Southern印迹杂交与Northern印迹杂交，特异核酸的分子大小可通过凝胶电泳分开形成不同的DNA或RNA条带，转移固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上与Eu标记的核酸探针进行杂交分析。DELFIA系统由于需加增强液检测，无法定位电泳条带，不适于进行Northern印迹杂交与Southern印迹杂交分析。在FIAgen系统与EALL系统中，引入到杂交体系的Eu3+螯合物即为荧光复合物，无需加增强液即可用时间分辨荧光扫描仪进行分析。在Southern和No

7、rthern印迹杂交技术中能准确定位并检测特异的DNA或RNA电泳条带。2镧系离子标记核酸探针检测DNA杂交技术镧系离子标记核酸探针是八十年代末发展起来的新技术．它克服了放射性核素标记的半衰期短、放射性危害等缺点越来越广泛地应用于核酸杂交分析，是迄今最为理想的一种非放射性检测方法。现将几种镧系离子标记DNA探针及检测方法简述如下。2．1免疫化学测定法Syvanen应用TRF发展了一种斑点杂交(dotblot)技术。该法是用半抗原AAIF(7—碘—N—乙酸基—N—2—乙酸氨茁)或Sulfone(矾)修饰DNA探针，与固定

8、在硝酸纤维素膜上靶DNA杂交，而后用二步免疫法检测，先加入抗半抗原抗体与半抗原结合，再加Eu3+标记的第二抗体IgG—DTPA—Eu3+进行检测。最小可测值为20pgAd2DNA，相当于5×105个分子。2．2生物素—链亲和素〔BAS〕法Dehlen将生物素—链亲和素系统引入TRF中，简称BAS—TRF法。用PBSIA缓冲液将变性