盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究

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1、盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究李芳余加林杨华李禄全陈波曼【摘要】目的构建铜绿假单胞菌发光菌株，建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm，BF)模型，研究盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌成熟BF的影响及与环丙沙星合用是否具有协同杀菌作用。方法将携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的质粒转染铜绿假单胞菌，平板培养法培养铜绿假单胞菌BF，建立铜绿假单胞菌BF体外模型，经盐酸氨溴索作用后，扫描电镜(scanningelectronmicroscope，SEM)观察盐酸氨

2、溴索对BF形态结构的影响，荧光显微镜定性观察盐酸氨溴索对BF内活菌的作用，通过发光菌株荧光强度定量分析盐酸氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌量。结果盐酸氨溴索作用后电镜观察可见黏液样物变稀疏，不规则。盐酸氨溴索浓度大于0.49mg/mlBF内活菌数减少(F=18，P0.05)；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1，P0.05)，且随着盐酸氨溴索浓度升高协同作用增强。结论盐酸氨溴索破坏铜绿假单胞菌成熟BF形态结构，减少其内活菌数；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用，增强其杀菌能力。【关键词】盐酸氨

3、溴索；环丙沙星；铜绿假单胞菌；生物膜ABSTRACTObjectiveToestablishabiofilmmodelofPseudomonasaeruginosainvitroandobservetheeffectofambroxolonbiofilmofPseudomonasaeruginosa,andstudythesynergisticeffectens.MethodPlasmidscarriedonasaeruginosa.PlateculturemethodmodelofPseudomonasaeru

4、ginosainvitro.Afterambroxol,theappearanceofthebiofilmicroscope(SEM),andtheviablecountsofbacterialinbiofilmaftertreatedbyambroxolaloneandtogetherinedbybio-fluorescencemethod.ResultAfteraddingambroxol,thebiofilmalparedicroscopeshog/ml,destroyedfurthermore,there

5、broxolandciprofloxacin(F=15.1,P0.05).Theeffectenhancedbroxol.ConclusionAmbroxoldestroyedfurthermorethebiofilmshapeofPseudomonasaeruginosa,restraineditsgrobroxol;Ciprofloxacin;Pseudomonasaeruginosa;Biofilm生物膜(biofilm，BF)是细菌黏附在物体表面上形成的一种具有高度结构性的膜状复合物，其主要成分是细菌分泌

6、的胞外基质和细菌菌体〔1〕。BF可使细菌具有抵御宿主免疫系统和抗菌药物杀伤作用，产生对抗菌药物的高度耐药性(可达到浮游状态的10～1000倍)，导致感染难以治愈〔2〕。铜绿假单胞菌是常见细菌生物膜相关感染病原菌之一，铜绿假单胞菌生物膜的形成是呼吸机相关性感染难以控制的重要原因。作者曾研究氨溴索可显著促进环丙沙星对细菌生物膜的透过〔3〕，本研究发现盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌BF有抑制作用，且与环丙沙星联用后具有协同作用，增强杀菌活性，现报道如下。　　1材料和方法1.1材料菌株PAO1(购自四川大学微生物实验室)，Lu

7、ria-Bertani培养基(LB，上海升博生物技术公司)，盐酸氨溴索标准品(德国BoehringerIngelheim)；环丙沙星标准品(重庆市药品检定所)，比浊仪(德国Siemens公司)，多功能酶标仪(美国BIORADUV-3350型)，荧光显微镜(德国Leica公司)，SEM(美国Amary公司)，24及96孔培养板(美国Coring公司)。1.2方法(1)构建GFP标记的PAO1菌株采取电转化对PAO1进行GFP)标记。首先制备感受态PAO1，然后进行菌株pGFPuv质粒转化和转化菌株筛选，提取转化菌株

8、中质粒和转化菌株中质粒双酶切电泳鉴定，检测转化菌株中质粒稳定性。本实验获得较稳定遗传的GFP标记的PAO1菌株。(2)环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)的测定采用微量稀释法测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。(3)铜绿假单胞菌BF体外模型的建立用平板法培养铜绿假单胞菌BF〔4〕。取隔夜培养的含有铜绿假单胞菌的LB培养液，调至1.5×1