提升转基因动物基因打靶效率之锌指核酸酶技艺系统之建立

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1、提升转基因动物基因打靶效率之锌指核酸酶技艺系统之建立第一章文献综述动物转基因有着广泛的应用前景，如何实现外源基因的定点插入，并使其表达可控将成为研究的重点。目前，主要通过基因打靶技术实现外源基因的定点插入，由于基因打靶效率很低，限制了这一技术的广泛应用。基因打靶依赖于同源重组修复，如能在靶位点造成DNA双链断裂，可以大幅提高打靶效率。锌指核酸酶可实现基因组靶位点DNA双链断裂，将锌指核酸酶技术与基因打靶技术联合使用，必将成为动物转基因研究的热点。1.1锌指蛋白1.1.1锌指蛋白结构与功能1983年，Miller等人在非洲爪蟾卵母细

2、胞转录因子TFⅢA中发现了锌指蛋白（Milleretal.1985;Leeetal.1989）。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，其可识别并结合特定DNA序列，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物抗逆性等方面都发挥着重要的作用。根据其保守结构域的特点，可将锌指蛋白分为C2H2型、C4型和C6型三大类（赵楠等.2009）。C2H2型锌指蛋白是真核生物基因组中含量最高的DNA结合结构域。秀丽线虫基因组中超过3%蛋白质编码基因都含有DNA结合结构域，而超过0.7%基因都包含了至少一个C2H2型锌指蛋白结构域（Clarke

3、etal.1987）。C2H2型锌指蛋白具有固定结构模块，以特定的方式识别多种DNA序列，所以C2H2型锌指蛋白很适合用来设计人工锌指蛋白。C2H2型锌指蛋白氨基酸通用模块：(Tyr,Phe)-X-Cys-X2–4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-5–His，其中X代表非保守氨基酸(Milleretal.1985;Bergetal.1996)，单个锌指蛋白包含大概30个氨基酸和一个锌离子，构成一个ββα简单结构域（图1-1）。C2H2型锌指蛋白识别DN

4、A特点：（1）一个锌指蛋白识别3个连续的核苷酸；（2）识别螺旋侧链的特异氨基酸残基接触识别DNA；（3）多指锌指蛋白由多个锌指蛋白通过简单的连接序列连接组成；（4）锌指蛋白识别非对称的DNA序列，与亮氨酸拉链和螺旋-转角-螺旋两种DNA结合结构域识别结合方式不同(Pavletichetal.1991）。通过设计特定人工锌指蛋白，可识别并结合特定靶标DNA序列。人工锌指蛋白为基因治疗和分子生物学研究提供了一种新的强有力的工具。1.1.2人工锌指蛋白锌指蛋白能特异性识别DNA序列，通过设计人工锌指蛋白，将其与转录抑制结构域或激活结构域

5、相连接构成转录因子，可用于基因的表达调控；与非特异性核酸内切酶连接构成锌指核酸酶，用于基因敲除、编辑、敲入等。因此，锌指蛋白有着广泛的用途，如何获得特异性锌指蛋白是目前研究的热点和重点。目前，最大的锌指蛋白数据库为ZiFDB，数据库中有877种锌指，主要包括四类数据(FengliFuetal.2009):SangamoBioSciences:他们设计一类三联体锌指蛋白，其中每个锌指识别GNN核苷酸序列。Barbaslaboratory：他们采用模块组装的方法设计了大量能识别不同的三联体核苷酸序列的锌指蛋白。Toolgen：他们从人

6、类基因组中编码的锌指蛋白中筛选获得锌指蛋白。Jounglaboratory:他们采用OPEN的方法创造了大量三联体锌指蛋白，其识别9bp的靶序列。人工锌指蛋白的获得的方法主要有：筛选法和模块组装法。模块组装法是简单将各锌指模块连接用于识别目标序列。其优点在于简易快速，缺点在于设计出的联体锌指蛋白亲和力较低或者没有亲和力(Ramirezetal.2008)。随着锌指蛋白识别结合DNA机制深入研究，该方法将会成为一种高效的方法；筛选法可信度较高，但比模块组装法耗时并需要较高分子实验技能。人工锌指蛋白筛选的方法主要单杂交和双杂交两种。细

7、菌单杂交系统(Sundaretal.2006)，该方法在RNA聚合酶ɑ亚基C-端通过22个氨基酸残基linker连接锌指蛋白，其与弱启动子上游的靶序列结合并激活下游的报告基因，从而筛选有亲和力的锌指蛋白，测定报告基因的表达强度可以判断该锌指蛋白与靶序列的亲和力大小(图1-2)。第二章锌指蛋白筛选体系建立本实验基于细菌双杂交原理筛选锌指蛋白，主要载体包括：报告载体（pReport-LacZ）、随机锌指蛋白表达载体（pBD-Gal11p-ZFS）和激活载体(PAD-Gal4)。其基本原理锌指蛋白-Gal11P与Gal4相互作用启动下游

8、报告基因和筛选基因(图2-1)。本实验所筛选锌指蛋白为三指锌指，其识别9bp核苷酸序列，加上两侧各1bp的相关序列，总共为11bp。pReport–LacZ为报告载体（图2-1，黑色线条所示），其表达报告基因β-半乳糖普酶（L