猪sn基因锌指核酸酶和talen的筛选与鉴定

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1、猪Sn基因锌指核酸酶和TALEN的筛选与鉴定ScreeningandIdentificationoftheZincFingerNucleaseandTALENTargetingPorcineSnGene研究生：吴金龙学科：预防兽医学指导教师：孙怀昌教授扬州大学兽医学院2012年5月吴金龙：猪Sn摹冈锌指核酸酶和TALEN的筛选’j鉴定猪Sn基因锌指核酸酶和TALEN的筛选与鉴定研究生：吴金龙导师：孙怀昌教授中文摘要UllIIIIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIY2258806猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespirat

2、orysyndrome，PRRS)是危害全球生猪养殖业的重要疫病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)具有毒力差异大、变异快和诱导中和抗体水平低等特点，疫苗接种难以获得坚强的免疫保护。PRRSV主要感染猪巨噬细胞，主要由唾液酸粘附素(Sialoadhesin，Sn)和CDl63两个受体介导。与病毒蛋白相比，靶细胞上的病毒受体具有高度保守性，其基因修饰有可能阻断不同毒株的感染，已成为抗病毒感染新的研究方向。锌指核酸酶(zincfingernuclease，ZFN)是近年来

3、发展起来的一种定点基因修饰技术，而转录激活蛋白样效应分子核酸酶(transcriptionactivator．1ikeeffectornuclease，TALEN)则是更新的基因定点修饰技术。为了获得针对猪Sn基因的ZFN和TALEN用于体内转基因研究，本研究用两种策略分别设计了5对针对猪Sn基因的ZFN和1对针对猪Sn基因的TALEN，分别用体外转录／翻译系统和大肠杆菌表达系统进行表达，以表达产物和含目标序列的质粒DNA进行体外消化试验，旨在筛选具有特异裂解活性的ZFN或TALEN。经靶质粒体外切割试验证明，5对ZFN能与靶质粒结合，并能将超螺旋质粒部分线性化，但

4、切割活性较低。设计和合成的1对TALEN，用体外转录／翻译产物进行的体外切割试验证明能与靶质粒结合，左右TALEN共同作用能将超螺旋靶质粒部分线性化。然后将1对TALEN克隆入原核表达载体，在重组大肠杆菌中获得表达，表达产物主要为不溶性包涵体，用尿素变性／复性法获得了可溶性蛋白。用此纯化产物进行的体外切割试验结果显示，左右TALEN共同作用能将超螺旋靶质粒线性化。这些试验结果进一步表明，利用现有生物信息学软件设计和筛选有效ZFN的盲目性大、效率低，而设计和筛选有效TALEN的可靠性更强。关键词：猪sn基因；ZFN；TALEN；设计；筛选扬州人学硕lj学位论文2一Sc

5、reeningandIdentificationoftheZincFingerNucleaseandTALENTargetingPorcineSnGeneM．D．Candidate：WuJinlongSupervisor：Prof．SunHuaichangABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndromeisoneofthemostimportantdiseasesthreateningtheglobalpigindustry．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus

6、(PRRSV)isrecognizedwithgreatvirulencedifference，highmutationrateandlowantigenicity,thusitisdifficulttoobtainstrongimmuneprotectionwiththeexistingvaccines．PRRSVmainlyinfectsmacrophages，andwhichismediatedbysialicacidadhesin(Sialoadhesin，Sn)receptorsandCD163receptors．Comparedwithviralprot

7、eins，virusreceptorsontargetcellsishighlyconserved，SOtargetingvirusvectorsmayblocktheinfectionofdifferentvirusstrains，andthesetechnologieshavebecomethenewanti—viralinfectionstrategies．Zincfingernuclease(ZFN)technologyistherecentlydevelopedgenemodificationtechnology,whilethetranscripti