脂肪酶的分离纯化

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1、贺州学院课程考核试卷（论文）（2013—2014学年第1学期）课程名称：酶工程开课单位：化生学院考核年级、专业：11生物工程任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法，对Candidasp.99−125脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200U/mg，回收率为35.5%.SDS−PAGE电泳分析显示该酶的分子量约为38kDa.酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40℃，最适反应pH值为8.5，在室温下具有良好的稳定性.钙离子和Tween80能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子

2、、铜离子和SDS对其有明显的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶.与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candidasp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candidasp.99-125是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油[4]、维生素A酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究.然而该菌株生产

3、的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素.为此，本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candidasp.99-125脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2材料与方法2.1试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candidasp.99−125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS(SodiumDodecylSulfate)电泳仪；DEAESepharoseFF层析柱和PhenylSepharoseFF(Lowsub)层析柱.2.2实验方法2.2.1粗酶液的制备取2g粗酶粉溶于20mLTri

4、s-HCl(20mmol/L,pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液.粗酶液中蛋白的比活为2710U/mg.2.2.2离子交换层析法纯化脂肪酶以20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4mL粗酶液.先以Tris-HCl缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用0~0.4mol/L的NaCl溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15倍柱体积，最后以1mol/LNaCl溶液彻底洗脱结合蛋白.分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中

5、加入固体硫酸铵至0.8mol/L，将该溶液注入经0.8mol/L硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中.先用0.8mol/L硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.8~0.0mol/L的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10倍柱体积，最后以20mmol/LTris-HCl(pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白.分步收集洗脱液进行分析.2.2.4脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法[7].酶活定义：脂肪酶在40℃,pH为8.0的条件下水解橄榄油乳化液产生1μmol/min脂肪酸所消耗的酶量，即为1个

6、脂肪酶活力单位(记为1U).2.2.5蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford检测法[8].标准蛋白质为1mg/mL牛血清蛋白(BSA).2.2.6SDS−聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2倍SDS−PAGE上样缓冲液，经沸水浴加热3∼5min，得到电泳样品.电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150V.电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3结果与讨论3.1脂肪酶的纯化3.1.1离子交换层析采用DEAESepharoseFF(1mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280nm，流动相流速为0.8m

7、L/min，进样量为4mL.对上样后未被DEAE柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质.然后用NaCl溶液梯度洗脱，结果如图1所示.图1层析柱DEAE分离纯化脂肪酶图1显示有2个蛋白吸收峰(A,B)，A峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B峰为杂蛋白峰.活性测定表明，A峰的比活为16600U/mg，纯化倍数为6.1倍，酶收率为55.7%.但2峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candidasp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2疏水层析采用PhenylSepharoseFF(

8、1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8mL/min，进样量为4mL.对上样后未被Phenyl柱结合的蛋白