western blot失败经验总结

western blot失败经验总结

ID:11242422

大小:64.00 KB

页数:11页

时间:2018-07-10

western blot失败经验总结_第1页
western blot失败经验总结_第2页
western blot失败经验总结_第3页
western blot失败经验总结_第4页
western blot失败经验总结_第5页
资源描述:

《western blot失败经验总结》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库

1、western blot失败经验总结1我做了很久的WB,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做WB的话,感觉以“快速彻底裂解,先变性后保存”的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给loadingbuffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loadingbuffer100度充分变性,再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于WB的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ECL法下限是0.1ng,即100pg),最好在1

2、0ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量,千万别把样品搞稀了,否则就不好办了。最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何选等等。 western blot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意,不能混浊,有时候能用个3-4次,有时候第二次都不行了,事先前预电泳一下,看看气泡的均匀度;Buffer一定要淹过梳子孔,否则就会发现今天的蛋白不会跑;跑的时候先用低电压跑过浓缩胶,再换高电压跑分离

3、胶,不要追求速度,慢慢跑条带会分离的更好,特别是对于高分子量的目的蛋白;2、转膜我用的是湿转,Buffer一定要预冷,最好提前一天配好放4度;滤纸不要大过PVDF膜,防止短路;胶在负极,膜靠近正极,放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首;膜要标记好正反面;转膜过程中,经常过去看看,防止意外,如电泳仪接触不好。WESTERN BLOTTING心得1.  总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核):组织匀浆后,15000g,4度,20分钟后,取上清.Buffer:NP40750ul,脱氧胆酸钠0.5克,SDS0.1克,加1*PBS至100ml.再加入PM

4、SF(7.4mg/ml)0.1ml.(现用现加)7.4mg/mlPMSP异丙醇溶液:取AmgPMSF加A/7.4ml异丙醇.工厂-20度储存2.组织膜蛋白提取:所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液.加入10mlBufferA,用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm,4℃离心10min后,所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结 缔组织)(3)100000g,4℃离心1hr,弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm,4度,30分钟离心,取上清即可)。沉

5、淀用适量的BufferB重悬,4度过夜后,分装至EP管,Eppendorf台式离心机10000rpm,4℃离心30min。(4)收集所得上清液即为膜组份。BufferA:0.32M蔗糖,5mMTris-HCl(PH7.5),120mMKCl,1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上预冷。BufferB20mMHEPES(PH7.5),10%甘油,2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mM,PMSF,1ug/ml

6、Leupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存。 如果要定量的话,最好能立即根据浓度,加入上样缓冲,煮沸,4度保存。反复冻融蛋白会降解,浓度不准。考马斯亮兰G250测蛋白浓度:考马斯亮兰G250配方:G2500.4克,95%乙醇100ml,85%磷酸200ml,加水至2000ml,过滤后使用。BSA标准液:0.5mg/mlBSA,双蒸水配制。配制标准液(浓度分别为0,10,20,30,40,50ug/ul):  1  

7、2  3  4  53  6G250  3ml  3ml  3ml  3ml  3ml  3ml0.5mg/mlBSA  ------  20ul  40ul  60ul  80ul  100ulddH2O  100ul  80ul  60ul  40ul  20ul  -----待测蛋白配液:每管3mlG250,2ul样品,98ulddH2O。(若加入样品后,液体没有变蓝色,则可再加2ul样品,ddH2O减为96ul,标准液浓度可适当扩大。)紫外分光光度计,595nm,用1号管调零,制出标准曲线,标准方程及R值(R值应大于0.99, 否则操作误差较

8、大),测量待测蛋白OD值,算出蛋白浓度。(若加入2ul样品,则浓度值需除2,方为真正浓度;若加4ul样品,则

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。