western blot失败经验总结

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1、western blot失败经验总结1我做了很久的WB,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做WB的话,感觉以“快速彻底裂解,先变性后保存”的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给loadingbuffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loadingbuffer100度充分变性,再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于WB的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ECL法下限是0.1ng,即100pg),最好在10ng以上为好。这就要求

2、在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量,千万别把样品搞稀了,否则就不好办了。最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何选等等。western blot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意,不能混浊,有时候能用个3-4次,有时候第二次都不行了,事先前预电泳一下,看看气泡的均匀度;Buffer一定要淹过梳子孔,否则就会发现今天的蛋白不会跑;跑的时候先用低电压跑过浓缩胶,再换高电压跑分离胶,不要追求速度,慢慢跑条带会分离的更好,特别是对

3、于高分子量的目的蛋白;2、转膜我用的是湿转,Buffer一定要预冷,最好提前一天配好放4度;滤纸不要大过PVDF膜,防止短路;胶在负极,膜靠近正极,放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首;膜要标记好正反面;转膜过程中,经常过去看看,防止意外,如电泳仪接触不好。WESTERN BLOTTING心得1.  总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核):组织匀浆后,15000g,4度,20分钟后,取上清.Buffer:NP40750ul,脱氧胆酸钠0.5克,SDS0.1克,加1*PBS至100ml.再加入PMSF(7.4mg/ml)0.1ml.(现用现加)7.4mg/mlPMSP异

4、丙醇溶液:取AmgPMSF加A/7.4ml异丙醇.工厂-20度储存2.组织膜蛋白提取:所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液.加入10mlBufferA,用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm,4℃离心10min后,所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)(3)100000g,4℃离心1hr,弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm,4度,30分钟离心,取上清即可)。沉淀用适量的BufferB重悬,4度过夜后,分装至EP管,Eppendorf台式离心机10000rpm

5、,4℃离心30min。(4)收集所得上清液即为膜组份。BufferA:0.32M蔗糖,5mMTris-HCl(PH7.5),120mMKCl,1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上预冷。BufferB20mMHEPES(PH7.5),10%甘油,2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mM,PMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装EP管(每管约5

6、0ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存。如果要定量的话,最好能立即根据浓度,加入上样缓冲,煮沸,4度保存。反复冻融蛋白会降解,浓度不准。考马斯亮兰G250测蛋白浓度:考马斯亮兰G250配方:G2500.4克,95%乙醇100ml,85%磷酸200ml,加水至2000ml,过滤后使用。BSA标准液:0.5mg/mlBSA,双蒸水配制。配制标准液(浓度分别为0,10,20,30,40,50ug/ul):  1  2  3  4  53  6G250  3ml  3ml  3ml  3ml  3ml  3ml0.5mg/mlBSA  ------  20ul  

7、40ul  60ul  80ul  100ulddH2O  100ul  80ul  60ul  40ul  20ul  -----待测蛋白配液:每管3mlG250,2ul样品,98ulddH2O。(若加入样品后,液体没有变蓝色,则可再加2ul样品,ddH2O减为96ul,标准液浓度可适当扩大。)紫外分光光度计,595nm,用1号管调零,制出标准曲线,标准方程及R值(R值应大于0.99,否则操作误差较大),测量待测蛋白OD值,算出蛋白浓度。(若加入2ul样品,则浓度值需除2,方为真正浓度;若加4ul样品,则除4)聚

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