恶性肿瘤非编码rna相关蛋白的功能网络与调控机制的研究

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项目名称：恶性肿瘤非编码RNA相关蛋白的功能网络与调控机制的研究首席科学家：宋尔卫中山大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 一、研究内容本项目拟解决的关键科学问题是“恶性肿瘤非编码RNA相关蛋白的功能网络和调控机制及其与肿瘤发生发展和治疗抗性的关系”，包括以下四个方面：1）新的肿瘤ncRNA及相关蛋白的发现和作用机制；2）肿瘤ncRNA转录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；3）ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用；4）ncRNA相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系。围绕上述科学问题，本项目拟以我国常见的恶性肿瘤为疾病模型，研究肿瘤细胞内相关蛋白网络如何参与ncRNA的生物合成与基因调控功能，并探索它们之间的相互作用对肿瘤细胞生物学行为的影响，以及与肿瘤发生发展和治疗抗性的关系。主要研究内容包括：1）建立和优化适合于肿瘤研究的ncRNA组学方法和ncRNA相关蛋白研究体系，筛选和鉴定一批新的肿瘤相关ncRNA及其相互作用蛋白；2）探索DNA甲基化和组蛋白修饰及转录因子对肿瘤ncRNA的转录调控，以及相关蛋白在ncRNA转运、加工及修饰过程中的作用；3）探讨ncRNA及其相关蛋白对肿瘤启动细胞自我增殖、分化方向和成瘤特性的调控机制，阐明其与肿瘤发生的关系。研究ncRNA及其相关蛋白在肿瘤发展过程中对肿瘤细胞EMT，肿瘤转移和血管生成的作用；4）研究ncRNA及其相关蛋白调控肿瘤细胞凋亡、自噬的机制，解析常见恶性肿瘤中ncRNA及其相关蛋白对治疗抗性的影响。 二、预期目标本项目的总体目标以常见的恶性肿瘤为模型，通过研究非编码RNA（ncRNA）相关蛋白的功能网络和调控机制，发现一批新的肿瘤ncRNA及相关蛋白并揭示其作用机制；阐明肿瘤ncRNA转录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；解析ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用以及ncRNA相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系，使我国在恶性肿瘤ncRNA相关蛋白研究领域取得突破性进展，为我国在该领域培养一批优秀人才。本项目的五年预期目标1．建立适合于肿瘤研究的ncRNA相关蛋白的各种平台，包括适合于肿瘤研究的ncRNA组学技术平台，肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台；建立计算生物学和实验生物学有机结合的研究方法，系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性ncRNA及相关蛋白，揭示ncRNA及相关蛋白的相互作用机制。2．发现30-40个新的参与恶性肿瘤功能网络调节的ncRNA相关蛋白，包括参与肿瘤ncRNA基因的DNA甲基化、组蛋白修饰和转录，以及肿瘤ncRNA转运、加工及成熟修饰的相关蛋白；调节肿瘤启动细胞自我增殖、多向分化，成瘤能力等生物学特性的ncRNA相关蛋白；调节肿瘤细胞EMT和抗凋亡特性，以及肿瘤转移、血管生成和治疗抗性的ncRNA相关蛋白，为阐明恶性肿瘤ncRNA相关蛋白功能网络和调控机制提供新线索。3.阐明ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展和治疗抗性中的新的调控机制，包括肿瘤特异ncRNA相关蛋白的表观遗传调控机制，ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控机制，ncRNA相关蛋白对对肿瘤血管生成、以及肿瘤细胞迁移和EMT的调控机制，ncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡、自噬和治疗抗性的调控机制，深入研究10-20种左右具有临床意义的非编码RNA及相关蛋白，发现至少2－3条新的ncRNA相关蛋白参与的调控肿瘤发生发展和治疗抗性的信号转导通路，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。4．预计在SCI收录杂志发表论文80篇以上，其中IF>5分以上论文超过40 篇，争取在Cell、Nature、Science等顶尖杂志上发表高水平论文，申请专利10-15个。5．为我国在恶性肿瘤ncRNA相关蛋白研究领域培养一批高水平创新性人才，包括培养15-20名博士后等青年骨干人才，70－80名博士生，100名硕士生，产生百篇优秀博士论文1-2篇。 三、研究方案1.总体学术思路：以非编码RNA（ncRNA）相关蛋白调控网络在肿瘤发生发展与治疗抗性中的作用研究作为总体目标，本项目拟识别和鉴定一批肿瘤特异的ncRNA，筛选并确定参与它们在肿瘤细胞中异常表达及行使生物学功能的相关蛋白质。此外，探索ncRNA与相关蛋白之间的相互作用机制，及其对肿瘤细胞增殖、分化、转移、凋亡和治疗抗性等的作用，最终阐明肿瘤非编码RNA相关蛋白调控网络系统及功能，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。总体研究方案图示如下：ncRNA与调控其表达的蛋白相互作用识别和鉴定肿瘤ncRNA与相关蛋白ncRNA与行使其生物功能的蛋白相互作用ncRNA对靶蛋白的作用与肿瘤发生发展与肿瘤治疗抗性解析肿瘤ncRNA表达的调控机制l表观遗传机制对ncRNA表达的调控l转录因子对ncRNA的调控lncRNA合成、加工成熟与修饰过程及其与蛋白质相互作用的机理l肿瘤启动细胞及其在各向分化过程中的ncRNA及相关蛋白的时空表达谱lncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控与肿瘤发生lncRNA相关蛋白对肿瘤血管生成的调控作用lncRNA相关蛋白参与肿瘤细胞迁移、EMT和肿瘤转移的机制研究l肿瘤细胞凋亡与自噬过程相关的ncRNA及相关蛋白的筛选与鉴定lncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡和自噬过程的调控作用研究lncRNA相关蛋白在纳米颗粒引发的癌细胞自噬中的功能lncRNA相关蛋白对恶性肿瘤治疗抵抗作用的研究恶性肿瘤发生发展中的ncRNA及其相关蛋白调控网络Ø识别和鉴定新的肿瘤特异ncRNA及与其靶蛋白的作用机制Ø解析调控肿瘤ncRNA转录和加工修饰的蛋白质功能Ø阐明ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控作用与肿瘤发生的关系Ø揭示ncRNA相关蛋白对肿瘤血管生成与转移的作用与肿瘤发展的关系Ø探索ncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡和自噬的作用与肿瘤治疗抗性的关系 技术途径及可行性：本项目在总体目标的架构下分为4个主要的课题方向（见课题设置），各课题方向的主要技术途径总结如下：课题1：利用RNA组学研究方法，采用深度测序技术、DNA文库、基因芯片技术，高通量筛选和鉴定新的肿瘤相关ncRNA；采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、酵母三杂交技术、SELEX技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应方法，以及CLIP(crosslinkingandimmunoprecipitation)方法、蛋白复合体分离检测技术，结合生物信息学技术，规模化地系统性筛选、鉴定肿瘤特异性ncRNA相互作用蛋白，发现ncRNA与蛋白质相互作用规律。课题2：通过DAC/TSA处理法结合MSP和ChIP法，筛选、鉴定受表观遗传调控的ncRNA；通过DNA亲和层析、ChIP-Seq、荧光素酶报告系统等方法在肿瘤细胞中检测转录因子与启动子的结合活性；通过免疫共沉淀、酵母三杂交、SELEX、CLIP等技术分离和鉴定与ncRNA结合蛋白；用筛选调控转录后加工关键蛋白的miRNA；应用用免疫共沉淀方法鉴定ncRNA修饰蛋白，如lin-28等和候选miRNA前体的结合及体外催化实验鉴定恶性肿瘤细胞系中ncRNA修饰蛋白介导的候选miRNA前体尿嘧啶化；应用测序技术对ncRNA基因多态性进行分析。课题3：通过ncRNA芯片、ncRNA克隆和深度测序鉴定肿瘤启动细胞特异的ncRNA表达谱；通过生物信息学预测、蛋白组学、蛋白差异表达分析以及RNA干扰实验研究分离和鉴定ncRNA相关蛋白；通过平皿培养、三维Matrigel培养、免疫缺陷鼠移植瘤系统、ncRNA表达/拮抗实验研究ncRNA在肿瘤启动细胞中的生物学功能。采用划痕修复试验、转移小室（Transwell）的细胞迁移和侵润检测系统和荷瘤鼠转移模型等研究肿瘤转移能力；采用倒相性、荧光和共聚焦显微技术观察肿瘤细胞形态；采用小动物成像系统技术，动物外周学循环肿瘤细胞检测技术，组织学检测技术以及荧光定量PCR技术等检测ncRNA干预对恶性肿瘤转移的作用；通过免疫组化和免疫细胞化学等检测转移细胞ncRNA相关的蛋白通路激活状态。课题4：通过亲和层析法、酵母三杂交系统、ChIP-RT-PCR等技术筛选和鉴定ncRNA相关的凋亡蛋白；应用THF方法制备富勒烯纳米颗粒；用 动态光散射、透射电镜、HPLC等技术测定纳米颗粒的粒径、表面电势、浓度及分散度等理化性质；通过荧光观察GFP-LC3聚集，western检测LC3-I向LC3-II的转化，电子显微镜观察自噬体及自噬溶酶体，western检测p62和FreeGFP等进行自噬检测；通过检测细胞自噬特征性的GFP-LC3点状聚集，筛选自噬相关ncRNA；采用WesternBlotting,免疫组化以及酶活性检测等手段研究ncRNA生成过程中的重要蛋白质如Drosha、Dicer以及Argonaute2在细胞自噬过程中表达水平、分子形式以及细胞内定位可能的变化。本研究团队中有相当部分的研究人员具有多年从事肿瘤学或肿瘤学相关基础研究的科研经验，其中在Cell、Nature、Science、NEnglofMed系列杂志上发表的文章中与肿瘤相关的占60％。各课题组建立了适合于肿瘤研究的ncRNA相关蛋白的实验平台和分析平台，包括上述绝大部分技术途径，建立了多种化学致癌物诱导人体细胞恶性转化的模型，建立了肿瘤启动细胞的研究平台以及富集肿瘤启动细胞的动物模型和细胞模型，建立了多种肿瘤细胞抗性模型，这些均为本研究奠定了坚实的基础，保证了该项目的顺利进行。2.创新点与特色理论方面创新：（1）首次研究以ncRNA为核心的基因表达的蛋白质调控网络：本研究从ncRNA与蛋白质的相互作用入手，全面系统地解析以ncRNA为纽带的蛋白质功能网络对肿瘤的作用。一方面研究肿瘤细胞内调控ncRNA转录和加工的蛋白质功能，另一方面研究ncRNA与其相关蛋白组成的调控网络调节着肿瘤细胞编码蛋白质的癌基因和抑癌基因的表达，从而参与调节肿瘤细胞的多种生命现象。这一观点的提出与论证将为完善一个多通路、多层次的基因调控网络以解析恶性肿瘤的发生和发展机制奠定基础。（2）为恶性肿瘤的治疗提供新靶点：肿瘤的发生发展涉及多个编码基因的变异，而细胞内源性的ncRNA-蛋白质调控网络可调节多种基因的表达，因此，改项目将为恶性肿瘤的治疗提供更稳定有效的抗癌靶点。此外，肿瘤启动细胞是肿瘤发生、复发和转移的根源，对化疗和放疗不敏感。本项目通过筛选决定肿瘤启动细胞分化和生长命运的ncRNA及其相关蛋白，不仅为治疗恶性肿瘤提供了新的靶点，还提供了合适的靶细胞群，这将成为新一代的肿瘤基因治疗手段。 （3）为研究ncRNA相关蛋白调控肿瘤提供新的模型：本项目将着眼于恶性肿瘤内维持其生长的特殊细胞群——肿瘤启动细胞，通过筛选、识别和鉴定参与调节恶性肿瘤启动细胞基因表达的ncRNA及其相关蛋白质，研究它们对肿瘤启动细胞分化命运的调控作用，从而为ncRNA-蛋白质调控网络调节肿瘤发生发展的研究提供了一个动态的崭新的生物学模型。此外，最新的研究发现肿瘤细胞自噬与治疗抵抗有关，本研究通过分析自噬过程中ncRNA相关蛋白的功能，阐述其对肿瘤治疗抵抗的作用，为研究肿瘤治疗敏感性提供新模型。（4）在部分交叉研究领域进行首次研究：有关ncRNA及其相关蛋白调控肿瘤治疗抗性的研究在国际上才刚刚展开，目前尚缺乏系统和深入的研究；此外，目前文献中尚未有ncRNA相关蛋白调控细胞自噬的报道，结合课题组温龙平教授团队首次发现的纳米颗粒可以通过ncRNA调控细胞自噬，为纳米生物学及纳米安全性研究提供新线索。技术方法创新：（1）RNA组学平台在肿瘤特异ncRNA筛选中应用：本研究将采用RNA组学方法，并结合深度测序和计算生物学方法，建立高通量筛选和鉴定ncRNA技术平台，将有效地发现不同长度和类型的新的肿瘤特异的ncRNA。（2）肿瘤相关ncRNA相互作用蛋白系统研究：本研究采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、酵母三杂交技术、SELEX技术、CLIP(crosslinkingandimmunoprecipitation)方法以及蛋白复合体分离检测技术等多种新技术新方法，并有机结合计算生物学方法，理论与实验科学相结合，高通量和特异性相结合，是一种新的ncRNA相互作用蛋白研究策略。这也是国内首次开展大规模的肿瘤特异的ncRNA及其相关蛋白的发现和作用机制研究。 3.课题设置1）课题设置的思路本研究项目从发现和鉴定恶性肿瘤特异的非编码RNA(ncRNA)与其相关蛋白质出发，分别从ncRNA调节轴心的上游和下游研究ncRNA和相关蛋白的相互作用及相互调控机制，并阐述ncRNA及其相关蛋白在肿瘤自然发生发展和治疗抵抗等病理过程中的作用。课题的设置围绕这一学术思路展开，分为4个分课题：（1）肿瘤ncRNA及其相互作用蛋白的系统识别与机制研究；（2）肿瘤ncRNA转录加工相关蛋白的功能研究；（3）ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞和肿瘤转移的调控作用，及其与肿瘤发生发展的关系；（4）ncRNA相关蛋白质调控肿瘤细胞程序性死亡以及治疗抗性的功能研究。课题一：肿瘤非编码RNA及其相互作用蛋白的系统识别与机制研究1.研究内容：1）筛选和鉴定新的肿瘤相关非编码RNA以人常见肿瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)细胞系和人癌组织及正常组织标本为研究对象，建立和发展高通量ncRNA筛选和鉴定技术平台，针对不同的研究目的采用多种不同途径获得肿瘤特异的ncRNA分子。具体技术途径可包括：(1)采用RNA组学研究方法，分离制备RNA，采用罗氏454测序技术或IlluminaSolexa测序技术等方法，进行高通量测序分析和大规模筛选。（2）分离制备ncRNA分子，构建不同大小的ncRNA的cDNA文库(size-fractionedRNAlibrary)（包括我们建立非编码小分子RNA建库技术，FEBSlett.2005,579:3849-3854）和消减文库，对文库进行大规模筛选和高通量测序分析。(3)采用Invitrogen公司最新推出的为检测长ncRNA设计的NCodeNoncodingRNAArray（包含17112个人ncRNA分子）获得肿瘤特异的长度大于200bp的候选ncRNA分子；采用miRNA芯片分析，获得肿瘤特异的候选miRNA分子。针对获得的新数据和已有数据，结合生物信息学方法高通量发现新的不同长度和类型的ncRNA分子，获得常见肿瘤ncRNA表达谱，筛选差异表达ncRNA，获得常见肿瘤特异表达的候选ncRNA分子。针对获得的肿瘤特异的候选ncRNA分子，采用Northernblot、原位杂交 和/或实时定量PCR等技术对大样本肿瘤和正常组织标本及癌细胞系进行进一步鉴定分析，最终获得肿瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)ncRNA表达谱和特异表达ncRNA。2）系统分析和鉴定肿瘤特异非编码RNA的相互作用蛋白质建立和完善规模化的肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质发现、筛选和分析的规范化技术体系，获得一批与肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质分子。针对获得的肿瘤特异ncRNA分子，采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、筛选和鉴定RNA与蛋白质相互作用的酵母三杂交技术、SELEX(systematicevolutionofLigandsbyexponentialenrichment)技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应方法，以及CLIP(crosslinkingandimmunoprecipitation)方法、蛋白复合体分离检测技术，结合生物信息学技术，筛选、鉴定肿瘤特异性ncRNA相互作用候选蛋白质。经肿瘤细胞内外验证，获得一批肿瘤ncRNA相互作用蛋白质分子，为ncRNA相关蛋白的生物学功能研究提供保证。miRNA是目前哺乳动物细胞研究最成熟的ncRNA，在分析和鉴定miRNA靶基因蛋白方面，本项目研究人员中山大学生科院的蒋嵩山副教授前期的研究构建了600多个人miRNA基因的慢病毒表达载体和质粒表达载体，通过内源性提高miRNA的表达，并进行蛋白质组学分析，系统地筛查肿瘤相关miRNA的靶基因。结合通过同位素标记氨基酸的SILAC方法，可获得相关度非常高的miRNA-靶蛋白调节关系。在生物信息学软件预测的参考下，通过荧光素酶报告系统对miRNA-靶蛋白调节关系进行鉴定，最终系统地获得肿瘤相关miRNA的调节谱，作为后续研究的基础。3）肿瘤特异非编码RNA与相互作用蛋白的作用机制阐明ncRNA与蛋白质相互作用的序列和结构规律对揭示ncRNA与相互作用蛋白质分子的作用机制具有重要意义。首先针对获得的ncRNA相互作用蛋白质，采用计算生物学方法，以实验证实的ncRNA与蛋白相互作用为基础，开展基于机器学习的ncRNA与蛋白相互作用研究。探讨三个问题：①与某一特定蛋白结合的若干RNA的结合区特征识别；②与某一特定类型RNA结合的若干蛋白的结合区特征识别；③ 开展基于机器学习的ncRNA与蛋白相互作用的预测研究，构建分类模型，预测与某一特定ncRNA结合的所有可能蛋白或与某一蛋白结合的所有可能ncRNA，最终为实验提供计算生物学支持。结合计算生物学的分析结果，对获得的肿瘤特异的ncRNA分子进行碱基或序列片段进行替换、缺失，采用规模化研究蛋白质与RNA相互作用技术在细胞内外探索ncRNA与蛋白质相互作用，揭示蛋白质-ncRNA的相互作用方式，进而发现ncRNA与蛋白质相互作用的序列和结构规律，为基础和应用研究提供条件。4）肿瘤特异非编码RNA相互作用蛋白在肿瘤中的定性、定量和定位研究针对获得的肿瘤特异ncRNA及其相互作用蛋白质，对各种常见肿瘤标本进行定性、定量和细胞定位分析，揭示其在肿瘤中表达的动态时空关系。应用NorthernBlot、实时定量RT-PCR技术和原位杂交等原位技术对肿瘤相关ncRNA的表达进行定位和定性研究，以确认肿瘤相关ncRNA及其相关的靶基因蛋白在恶性肿瘤中的上调/下调关系。应用WesternBlot和免疫组织化学技术，对肿瘤相关ncRNA相关蛋白在恶性肿瘤中的表达进行定量或半定量检测。结合表达谱筛选数据，对肿瘤相关ncRNA及相互作用蛋白的角色即癌基因/抑癌基因进行确认，并与功能研究衔接。2.研究目标：1）建立肿瘤非编码RNA相互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台。2）系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性非编码RNA及相关蛋白，揭示非编码RNA及相关蛋白的相互作用机制。承担单位：军事医学科学院课题负责人：郑晓飞研究员经费比例：23.71%课题二：肿瘤非编码RNA转录加工相关蛋白的功能研究1.研究内容：1）肿瘤ncRNA表达的表观遗传调控 DNA甲基化和组蛋白修饰是ncRNA表观遗传学调控的主要形式，ncRNA之间的表达调控也属于表观遗传学调控的范畴。首先通过分析肿瘤表观遗传学改变与ncRNA表达谱之间的关系获得候选的表观遗传学调控的ncRNA。然后验证ncRNA表达和启动子区域DNA甲基化的对应关系，并比较DNA甲基化酶抑制剂（DAC）处理前后相关ncRNA的表达情况，确认ncRNA表达受DNA甲基化调控。应用抗活性乙酰化(acetyl-H3K9)和甲基化组蛋白抗体（dimethyl-H3K4、H3K36）特异识别处于活化状态的染色质；同时应用抗失活染色质的甲基化组蛋白抗体(trimethyl-H3K9、H4K20和trimethyl-H3K27)进行染色质免疫沉淀分析；结合TSA处理前后ncRNA的表达与组蛋白修饰状态以明确组蛋白修饰对ncRNA的调控作用。ncRNA本身也可通过与甲基化相关蛋白的相互作用进而调控其它基因和ncRNA的表达。本研究还将通过分析肿瘤相关ncRNA的表达与DNMTs活性的关系筛选出调控DNMTs的候选ncRNA，并对其蛋白调控网络进行分析。2）肿瘤ncRNA转录因子的识别与功能鉴定为了识别和鉴定肿瘤ncRNA的转录因子，本课题首先应用ncRNA启动子区域作为诱饵从蛋白库中筛选出与其特异结合的蛋白质，并通过功能实验探讨该蛋白对肿瘤ncRNA转录的影响，并进一步鉴定该转录因子所调控的ncRNA转录谱。另一方面，应用ChIP-Seq方法在肿瘤细胞中检测并筛选与已知的肿瘤相关转录因子，如c-myc、p53等相结合的ncRNA基因启动子区域，以获得肿瘤相关转录因子的ncRNA基因启动子结合谱。3）肿瘤ncRNA成熟加工的机制ncRNA在转录后至成熟过程中，需经过多种蛋白和酶类的调控，我们将在肿瘤模型中研究ncRNA转录后加工相关蛋白的表达情况、并分析过度表达或敲低后对肿瘤相关ncRNA表达谱的影响。通过免疫共沉淀、酵母三杂交、SELEX、CLIP等技术分离和鉴定此过程中的调控蛋白并研究其功能。我们也将选择与各类ncRNA成熟加工相关的蛋白分子（如与miRNA加工相关的Drosha、Dicer及Argonaute2等），将其基因的3’-UTR克隆至双荧光素酶报告系统，采用课题组1创建的miRNA表达库在全基因组范围内系统地筛选可能调控这些蛋白的miRNA，并结合课题1中所鉴定的常见恶性肿瘤特异性ncRNA表达谱，通过两者交集探讨恶性肿瘤特异性miRNA对ncRNA在转录后至成熟过程的负反馈调控网络。4）肿瘤成熟ncRNA异常修饰的机制 近期研究发现，ncRNA在代谢过程中被异常修饰将会导致其降解，从而影响细胞内成熟ncRNA的水平。例如lin28通过调节let-7前体尿嘧啶化介导的let-7前体降解。因此，本课题将识别和鉴定一批异常修饰肿瘤相关ncRNA而导致其表达改变的蛋白质，并探讨其作用机制。在肿瘤标本中分析从课题1中筛选、鉴定的ncRNA相关蛋白与ncRNA表达水平的相关性。通过在肿瘤细胞系中过度表达或用RNAi方法沉默该候选蛋白的表达，观察不同成熟阶段的相关ncRNA的表达变化。进一步通过CLIP(crosslinkingandimmunoprecipitation)方法和体外催化实验鉴定相关蛋白与ncRNA的结合以及对其修饰的方式。此外，ncRNA的序列多态性也是影响其成熟加工的重要因素。本课题将应用测序技术对ncRNA基因多态性进行分析，明确SNP对肿瘤相关ncRNA成熟加工的影响。2.研究目标：1）明确肿瘤ncRNA表达的表观遗传调控机制及相关蛋白（酶）在ncRNA-蛋白调控网路中的作用。2）分离和鉴定一批新的调控肿瘤相关ncRNA的转录因子，并揭示其在ncRNA-蛋白调控网路中的作用。3）获得一批肿瘤ncRNA加工成成熟过程及成熟后异常修饰相关的蛋白并阐明其功能。承担单位：中国人民解放军总医院课题负责人：郭明洲研究员经费比例：22.12%课题三、非编码RNA相关蛋白对肿瘤启动细胞和肿瘤转移的调控及其与肿瘤发生发展的关系1.研究内容：1）完成肿瘤启动细胞的ncRNA及相关蛋白表达谱 肿瘤启动细胞在肿瘤组织内数量稀少，是制约其高通量分子表达谱研究的瓶颈，课题组前期研究建立了高效的肿瘤启动细胞筛选富集体系，即通过低剂量化疗选择压力，在荷瘤鼠中选择出具有高比例肿瘤启动细胞的肿瘤细胞株。该研究体系可以推广到其他恶性实体瘤，以获得足够数量的肿瘤启动细胞供本研究所用。我们将（1）以各类常见恶性肿瘤的启动细胞作为材料，采用不同大小的ncRNA的cDNA文库（size-fractionedRNAlibrary）和肿瘤启动细胞体外球囊培养扩增等策略构建各种肿瘤启动细胞专一性的小分子ncRNA的cDNA文库。对文库进行大规模筛选和序列测定分析，预期可发现一批肿瘤启动细胞特异的ncRNA。（2）结合ncRNA芯片及克隆测序技术，分析比较肿瘤启动细胞和相应的非启动癌细胞中ncRNA表达谱的差异，以及肿瘤启动细胞在向上皮型和间质型成熟癌细胞分化过程中ncRNA表达谱的变化，发现和鉴定肿瘤启动细胞特异表达的新ncRNA。在此基础上，我们将在原发恶性肿瘤组织中分离原代的肿瘤启动细胞，通过Northern杂交法鉴定新发现的专一ncRNA表达，通过实时PCR对其定量，再通过原位杂交对其定位。（3）通过计算机预测系统和蛋白组学技术分析和鉴定ncRNA相关的蛋白谱，并鉴定ncRNA相关蛋白质在各类原代肿瘤启动细胞的表达及其与ncRNA表达的相关性。2）ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控作用通过前期研究所建立的一系列肿瘤启动细胞研究模型，分析ncRNA-蛋白质调控网络对肿瘤启动细胞生物学特性，包括自我增殖能力、多向分化的潜能和体内成瘤能力的调控作用。（1）自我增殖是肿瘤启动细胞赖以维持自我的主要特征，也是恶性肿瘤发生和发展的源泉。无血清培养条件下，肿瘤启动细胞在悬浮状态下形成细胞球囊（sphere），球囊形成率反映细胞自我增殖的能力。我们将进行专一性的ncRNA干预，然后分析肿瘤启动细胞球囊形成率，并通过蛋白差异表达分析以及相关RNA干扰实验明确ncRNA相关蛋白与肿瘤启动细胞球囊形成和自我增殖能力的关系。（2）采用二维平皿及三维Matrigel培养和免疫缺陷鼠体内种植等研究体系，并利用上皮细胞和间叶细胞的表面标记物，进一步明确目标ncRNA对肿瘤启动细胞分化方向的影响。（3）检测过表达或沉默ncRNA后肿瘤启动细胞成瘤能力的变化，并分析ncRNA相关蛋白的调控网络，以阐明ncRNA-蛋白调控网络与肿瘤发生的关系。3）ncRNA相关蛋白对肿瘤转移的作用 在课题1识别和鉴定肿瘤特异ncRNA和相关蛋白特异表达谱的基础上，我们将进一步筛选鉴定与肿瘤细胞转移密切相关的ncRNA及其相关蛋白，在体外和体内模型中研究这些ncRNA及其相关蛋白质对肿瘤细胞转移特性的调节作用与机制。首先，我们在肿瘤细胞中转导目标ncRNA的表达序列或者其拮抗序列，然后：①采用划痕修复和转移小室（Transwell）技术检测ncRNA干预对肿瘤细胞迁移（Migration）和侵袭（Invasion）的作用，并分析相关蛋白通路的激活状态；②采用倒相性、荧光和共聚焦显微技术，以及Matrigel细胞三维培养系统观察ncRNA干预对肿瘤细胞EMT形状的作用，并鉴定调节EMT的蛋白信号分子的激活状态；③在免疫缺陷鼠肾包膜或皮下种植以及鼠尾静脉注射肿瘤细胞，采用活体成像技术，组织病理学检测以及荧光定量PCR等技术检测ncRNA对恶性肿瘤转移的调控作用，同时，通过免疫组化和免疫荧光等检测转移细胞ncRNA相关的蛋白通路激活状态。4）ncRNA相关蛋白对肿瘤血管生成的调控作用肿瘤血管生成是恶性肿瘤发展过程的重要事件，研究证实肿瘤细胞可以通过分泌促血管生成因子，诱导血管内皮细胞向肿瘤组织迁移并增殖，也可以诱导组织内多能干细胞分化为血管内皮细胞。最近的研究还发现，肿瘤启动细胞也可向血管样内皮的方向分化，形成肿瘤的新生血管。因此，本课题中我们将探索在恶性肿瘤的微环境中ncRNA-相关蛋白质调控网络对血管内皮细胞的增殖、分化与迁移的调控作用，及其与肿瘤血管生成的关系。具体研究内容包括：①基于课题1所建立的ncRNA及其相关蛋白的检测平台，在与肿瘤细胞共培养的模型里，分析正常组织干细胞向血管内皮细胞分化过程中，以及血管内皮细胞增殖过程中ncRNA及其相关蛋白的时空变化规律，筛选出与血管内皮增殖和分化相关的ncRNA及其相关蛋白；②通过在血管内皮细胞以及正常组织干细胞转导ncRNA表达序列或其拮抗序列，分析上述筛选的ncRNA及其相关蛋白对肿瘤细胞所诱导的血管内皮细胞增殖、分化和迁移的作用；③在肿瘤启动细胞向血管样内皮细胞分化的模型中，通过转导上述筛选的ncRNA表达序列或拮抗序列，分析其调控作用。2.研究目标：1）完成肿瘤启动细胞的ncRNA及相关蛋白表达谱 2）揭示ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控机制及其与肿瘤发生的关系3）阐明ncRNA相关蛋白对肿瘤血管生成、侵袭、转移和EMT转化的调控机制承担单位：中山大学课题负责人：宋尔卫教授经费比例：30.46%课题四：非编码RNA相关蛋白质调控肿瘤细胞程序性死亡以及治疗抗性的功能研究1.研究内容：1）ncRNA相关蛋白在肿瘤细胞凋亡中的功能研究利用课题1中系统筛选和鉴定所得到的与细胞凋亡相关的ncRNA，在细胞及动物整体水平上揭示这些ncRNA所调控的靶蛋白参与细胞凋亡的传导通路，并阐明这些ncRNA相关蛋白影响肿瘤发生发展的分子机理。在此基础上，我们将从调控细胞凋亡的关键蛋白入手，针对性地选择在凋亡过程中起关键作用的（masterregulator）促凋亡或抗凋亡调控蛋白（例如p53、E2F1、Puma、Bax、Bcl-2、Bcl-xL等），将这些基因的3’-UTR克隆表达，然后利用课题1创建的miRNA表达库来系统筛选影响凋亡/抗凋亡的新的ncRNA；我们还将利用IP-ChIP和酵母三杂交系统寻找与这些3’-UTR相结合的蛋白，进一步探索这些与3’-UTR相互作用的新的ncRNA和新的蛋白(novelproteins)是如何通过调控细胞凋亡或抗凋亡来影响肿瘤的发生发展。miR-17-92cluster是目前公认的第一个非编码癌基因（Noncodingoncogene，OncomiR-1）,它在许多肿瘤中都呈现高表达。Mir-17-92本身是受Myc正调控，但它又能正向调控E2F1、PTEN以及Bim等众多由它们介导的肿瘤调控网络通路；Mir-17-92同时还受到hnRNPA1的成熟加工的调控，因此，miR-17-92是研究ncRNA凋亡网络的典范。我们初步的研究证实：B23通过与hnRNPA1相互作用调控mir-17-92的在细胞内的水平。因此，我们将以mir-17-92的研究为切入点，探索它参与细胞凋亡和肿瘤发生的复杂的分子调控机理。2）ncRNA相关蛋白在肿瘤细胞自噬中的功能研究 以我们已构建的稳定表达GFP-LC3蛋白的乳腺癌和HeLa癌细胞系为实验系统，利用课题1创建的ncRNA表达库，筛选出能诱导或抑制癌细胞自噬的ncRNA，然后鉴定这些ncRNA的靶蛋白及其调控细胞自噬的分子机理；针对性地选择一些已知在细胞自噬过程中起着关键调控作用的关键蛋白质如Beclin-1和ATG5，筛选能调控这些蛋白质表达水平的ncRNA，并验证所得到的ncRNA在细胞自噬过程中的功能；探讨ncRNA生成过程中的重要蛋白质如Drosha、Dicer以及Argonaute2在细胞自噬过程中表达水平、分子形式以及细胞内定位可能的变化；在现有工作基础上进一步确认ncRNA及相关蛋白在纳米颗粒引发的癌细胞自噬中的变化，并通过过表达和Knock-down等手段揭示这些ncRNA及相关蛋白在细胞自噬中所起的作用。3）ncRNA相关蛋白在肿瘤治疗抗性中的功能研究（1）肿瘤治疗抗性相关模型建立与组织样本的收集：建立一系列针对各类肿瘤治疗产生抵抗作用的肿瘤治疗抗性模型，包括对化疗、放疗、内分泌治疗和靶点药物治疗的抗性模型；收集在术后经历了不同种类的辅助治疗的病人的样本并制作组织芯片，同时收集病人的临床治疗和完成5年随访工作。（2）肿瘤治疗抗性相关ncRNA的筛选和鉴定：一方面运用肿瘤治疗抗性相关模型和课题1建立的方案分离和构建不同大小的ncRNA文库(size-fractionedRNAlibrary)和消减文库，运用IlluminaSolexa测序技术等方法对文库进行大规模筛选和高通量测序分析，结合生物信息学方法高通量发现新的ncRNA分子以及筛选差异表达ncRNA，获得肿瘤治疗抗性特异表达的候选ncRNA分子。在前期课题组各团队收集的肿瘤患者标本中，通过实时定量RT-PCR和原位杂交等研究所筛选的ncRNA表达。另一方面，从与肿瘤治疗抗性相关的蛋白质入手，选择对各种治疗抗性起重要调控作用的因子（如HER2、ERα，Met、EGFR等）及其相关的信号传导通路中的关键分子（如ATM、CHK-1,2，BRCA1、Akt，MPAK家族等），通过系统地克隆其3’UTR，并利用已经创建的ncRNA表达库来系统筛选并鉴定与上述因子关联的新的ncRNA。（3）肿瘤治疗抗性相关ncRNA相关蛋白的筛选和鉴定：利用前期构建的ncRNA的慢病毒表达载体库，通过瞬时提高或沉默内源性特定ncRNA的表达，并进行SILAC定量蛋白组分析，系统地筛查肿瘤相关ncRNA的靶蛋白； 利用SELEX、亲和层析富集和纯化以及酵母三杂交系统等技术发现和鉴定此抗性过程中与这些3-UTR相结合的蛋白，从而进一步探索肿瘤抗性中ncRNA相关蛋白的调控网络。通过WesternBlot和免疫组化等研究ncRNA相关蛋白的表达。（4）肿瘤治疗抗性相关ncRNA相关蛋白的功能研究：运用细胞生存和凋亡检测研究ncRNA相关蛋白在过表达或者表达沉默的状态下肿瘤细胞对治疗药物的敏感性；进一步揭示ncRNA相关蛋白调控治疗抗性的相关信号传导通路2.研究目标：1）阐明非编码RNA相关蛋白在肿瘤细胞凋亡和自噬过程中的分子调控机理。2）揭示非编码RNA相关蛋白在治疗抗性中的作用机制和信号传导通路。承担单位：中国科学技术大学课题负责人：吴缅教授经费比例：23.71%4.课题间相互关系本项目设置的4个课题分别从功能和机制两个角度探索肿瘤特异ncRNA相关蛋白在恶性肿瘤自然发生发展和治疗抗性中所扮演的角色。课题1为其它课题提供筛选与鉴定平台，拟发现一批肿瘤相关ncRNA与相关蛋白。在此基础上，课题2则沿ncRNA-相关蛋白轴心向上游鉴定肿瘤细胞内调控ncRNA表达的蛋白质及其功能，而课题3与4则分别从肿瘤发生发展和治疗抗性两个方面研究ncRNA-相关蛋白轴心下游的功能网络。四个课题是预期目标的四个有机组成部分，其相互关系如下图所示： 课题1：肿瘤ncRNA及相关蛋白筛选和鉴定平台课题2：调控肿瘤ncRNA转录和加工修饰的相关蛋白质功能课题3：调控肿瘤发生发展的ncRNA相关蛋白功能课题4：调控肿瘤治疗抗性的ncRNA相关蛋白功能上游：调控机制下游：功能网络课题设置与项目总体目标的关系针对本项目的总体目标，课题1将系统地发现一批新的肿瘤ncRNA及相关蛋白；课题2将阐明肿瘤ncRNA转录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；课题3及课题4将具体、深入地解析个别具有临床意义的ncRNA及其相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用以及ncRNA相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系。课题设置与本项目的五年预期目标的关系1．课题1将建立适合于肿瘤研究的ncRNA相关蛋白的各种平台，包括适合于肿瘤研究的ncRNA组学技术平台，肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台；建立计算生物学和实验生物学有机结合的研究方法，系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性ncRNA及相关蛋白，揭示ncRNA及相关蛋白的相互作用机制。2．课题2、3、4预计将 发现30-40个新的参与恶性肿瘤功能网络调节的ncRNA相关蛋白，包括参与肿瘤ncRNA基因的DNA甲基化、组蛋白修饰和转录，以及肿瘤ncRNA转运、加工及成熟修饰的相关蛋白；调节肿瘤启动细胞自我增殖、多向分化，成瘤能力等生物学特性的ncRNA相关蛋白；调节肿瘤细胞EMT和抗凋亡特性，以及肿瘤转移、血管生成和治疗抗性的ncRNA相关蛋白，为阐明恶性肿瘤ncRNA相关蛋白功能网络和调控机制提供新线索。3.课题2、3、4将着眼于阐明ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展和治疗抗性中的新的调控机制，包括肿瘤特异ncRNA相关蛋白的表观遗传调控机制，ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控机制，ncRNA相关蛋白对对肿瘤血管生成、以及肿瘤细胞迁移和EMT的调控机制，ncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡、自噬和治疗抗性的调控机制，深入研究30-40种左右具有临床意义的非编码RNA及相关蛋白，发现至少2－3条新的ncRNA相关蛋白参与的调控肿瘤发生发展和治疗抗性的信号转导通路，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。 四、年度计划研究内容预期目标第一年1.测定常见肿瘤ncRNA表达谱，并进行肿瘤启动细胞及肿瘤细胞转移、肿瘤治疗抗性相关的特异性ncRNA及相关蛋白的系统筛选及鉴定。2.分离、鉴定新的受表观遗传学调控的非编码RNA3.制备纳米颗粒。1.获得新ncRNA基因，获得常见肿瘤的ncRNA表达谱及肿瘤特异的ncRNA分子，获得肿瘤启动细胞ncRNA及相关蛋白表达谱，得到肿瘤细胞转移、肿瘤治疗抗性相关的ncRNA及相关蛋白候选分子。2.筛选出一批新的受表观遗传调控的肿瘤非编码RNA及相关蛋白。3.制备出相关纳米颗粒并获得表征数据；获得一到两种纳米颗粒处理后有显著表达量变化的ncRNA。4.在SCI期刊发表论文7-11篇，其中IF>5的论文2-4篇。 第二年1.筛选、鉴定肿瘤特异性ncRNA相互作用候选蛋白质。2.筛选受甲基化调控的非编码RNA,研究组蛋白修饰对ncRNA的调控作用。3.在肿瘤启动细胞血管生成模型中筛选及鉴定与肿瘤血管生成相关的ncRNA及相关蛋白，构建ncRNA表达载体并分析ncRNA调控的下游蛋白。4.研究纳米颗粒处理后有显著表达量变化的ncRNA的表达模式差异，并验证其在细胞自噬中发生的作用并研究其作用机理；鉴定治疗抗性相关ncRNA的靶基因蛋白。1.得到肿瘤特异性ncRNA相互作用蛋白。2.得到受甲基化调控的非编码RNA,明确组蛋白修饰对ncRNA的调控作用。3.筛选出肿瘤血管生成相关ncRNA，完成ncRNA及相关蛋白的载体构建4.阐明纳米颗粒处理后有显著表达量变化的ncRNA在细胞自噬中所起的作用；得到治疗抗性相关ncRNA的靶基因蛋白。5.在SCI期刊发表论文18-21篇，其中IF>5的论文6-12篇。第三年1.结合计算生物学的分析结果，采用规模化研究蛋白质与RNA相互作用技术在细胞内外探索ncRNA与蛋白质相互作用，揭示蛋白质-ncRNA的相互作用方式。2.筛选调控肿瘤相关非编码RNA转录的转录因子，鉴定转录因子的转录活性及转录因子结合的启动子区域。从蛋白库中筛选启动子特异结合的蛋白质，并探讨其功能。3.1.确认肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白在肿瘤中的表达变化。发现ncRNA与蛋白质相互作用的序列和结构规律。2.获得肿瘤相关转录因子（如c-myc、P53等）调控的ncRNA转录谱以及转录因子的启动子结合谱。3.完成ncRNA及相关蛋白调控肿瘤启动细胞生物学功能的研究。4.鉴定出一到两种 进行ncRNA及相关蛋白在调节肿瘤启动细胞生物学功能的研究。4.筛选能诱导癌细胞自噬发生或者能抑制饥饿引发之自噬的ncRNA，探索几个ncRNA对肿瘤治疗抗性的作用机制。能诱导癌细胞自噬发生或者能抑制饥饿引发之自噬的ncRNA并鉴定其靶蛋白；完成1-2个非编码RNA调节肿瘤治疗抗性的研究。在SCI期刊发表论文10-16篇，其中IF>5的论文6-10篇。第四年1.对肿瘤相关ncRNA的表达进行定位和定性分析，采用过表达及报告基因技术系统筛查肿瘤相关miRNA的靶基因。2.对肿瘤非编码RNA的转录后加工酶系的表达进行定位、定性及定量检测。筛查新的ncRNA转录后加工相关的蛋白，并分析其功能。3.在肿瘤转移模型中探索ncRNA及相关蛋白影响肿瘤细胞侵袭、转移能力的作用。4.研究能诱导癌细胞自噬发生或者能抑制饥饿引发之自噬的ncRNA在细胞自噬中所起的作用，并研究其靶蛋白在细胞自噬中的作用1.确认肿瘤相关ncRNA在肿瘤中的表达变化。系统地获得肿瘤相关miRNA的调节谱。2.探明部分肿瘤相关ncRNA成熟后的修饰及降解的机制。筛选出调控转录后加工关键蛋白的miRNA。3.完成ncRNA调控肿瘤细胞侵袭、转移能力的作用研究。4.阐明能抑制饥饿引发之自噬的ncRNA在自噬这一生物学过程中的具体作用5.在SCI期刊发表论文10-16篇，其中IF>5的论文6-10篇。 第五年1.结合表达谱筛选数据，对系统筛查的肿瘤相关ncRNA及相互作用蛋白的角色即癌基因/抑癌基因进行确认，进行初步功能分析。2.应用恶性肿瘤相关ncRNA启动子区域作为诱饵从蛋白质库中筛选与其特异结合的蛋白质，并应用miRNAs表达库筛选与关键作用蛋白相关的miRNAs。3.在肿瘤启动细胞血管分化模型中研究ncRNA及相关蛋白的调控作用，探索ncRNA及相关蛋白对肿瘤血管生成作用的调节。4.研究ncRNA生成过程中的重要蛋白质如Drosha、Dicer以及Argonaute2在细胞自噬过程中亚细胞定位可能发生的变化。总结相关研究1.完成肿瘤非编码RNA及其相互作用蛋白的系统识别与机制研究。2.完成恶性肿瘤ncRNA相关蛋白对ncRNA表达的转录、转录后调控的研究。3.完成ncRNA及相关蛋白调控肿瘤发生、发展的研究。4.完成ncRNA及相关蛋白调控肿瘤治疗抗性及调节自噬的研究。5.在SCI期刊发表论文12-17篇，其中IF>5的论文8-12篇。