伤害沙门菌非编码rna asrc的相关功能研究

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1、分类号&2墨：2±3UDC鱼12密级公五编号一lQ2窆窆墨i垒l垒垒垒Z硕士学位论文伤寒沙门菌非编码RNAAsrC的相关功能研究ANALYSISOFTHEFUNCTIoNoFNoN．CoDINGRNAASRCINSALMoNELLAENTERICASERoVERTYPHI作者姓名：张晓磊指导教师：黄新祥教授小组成员：徐顺高副教授生秀梅副教授张海方副教授倪斌讲师张盈讲师申请学位：硕士学科专业：免疫学论文提交日期：20l3年4月26日论文答辩日期：2013年6月9日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2013年6月答辩委员会

2、主席：王胜军教授独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：嗽盛篆20I；年6月，{，日＼㈣㈣1111111IllllIII／111111II／／11I{Y2294329学位论文版权使用授权书江苏大学、

3、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生院办理。本学位论文属于不保密函。学位论文作者签名：嗽施磊≯I{年占月f11日指

4、导教师签名：—运x矽／产莎月，占日江苏大学硕士学位论文摘要目的：近十年来，通过生物学预测和计算机分析、基因芯片筛查以及高通量测序等手段，在细菌基因组内已经发现了一批非编码RNA(non．codingRNA，ncRNA)，它们作为基因表达的调控因子，在细菌中发挥重要作用。AsrC为本实验室在伤寒沙门菌中新发现的ncRNA，其基因位于rseC的互补链，本论文拟研究该非编码RNA在伤寒沙门菌中的相关功能。方法：1．伤寒沙门菌AsrC高表达菌株的构建。根据Northern鉴定出的AsrC，以及5’和3’RACE(末端快速扩增技术

5、)找到的转录起始及终止位点，从前期测序中找到该段全长序列。在5’起始端上游140bp处和3’终止端处分别设计上下游引物，扩增获得目的片段，经NcoI和HindIII双酶切，与同样酶切后的低拷贝质粒pBAD／Myc．HisA定向连接，并克隆至大肠埃希菌TOP10。经PCR、酶切验证和测序分析鉴定后，将阳性重组质粒和空质粒分别电击导入伤寒沙门菌野生株，作为AsrC高表达菌株和空质粒对照株。2．AsrC高表达菌株在不同条件下的生长曲线测定。以生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线，对比AsrC高表达菌株和空质粒对照

6、株在正常及酸、氧、高渗应激条件下的生长情况。3．AsrC高表达菌株的基因表达谱分析。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000．4)，加入0．2％(w／v)的阿拉伯糖诱导1h后分别提取总RNA，反转录为cDNA并配对互标荧光素cy3和cy5，利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，与基因组芯片杂交，扫描后将荧光信号数据化，分析比较伤寒沙门菌AsrC高表达菌株和空质粒对照株的伤寒沙门菌非编码RNAAsrC的相关功能研究基因表达谱差异。4．AsrC高表达菌株的动力实验。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对

7、数期(OD6000．4)后加入0．2％(w／v)的阿拉伯糖诱导1h，分别取野生株、asrC启动子缺失株、AsrC高表达菌株和空质粒对照株的2．5肛l菌液点种于O．3％的等渗半固体LB培养基，37。C培养8h后测量动力圈直径，两两比较细菌的动力。5．AsrC高表达菌株的上皮细胞侵袭实验。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000．4)，在0．2％(w／v)的阿拉伯糖诱导lh后，分别把野生株、asrC启动子缺失株、AsrC高表达菌株和空质粒对照株加入培养有HeLa细胞的24j：L板中(MOI均为20)。培养

8、90min后将部分孔的细胞破膜，收集菌体后涂板过夜，菌落数代表细菌粘附细胞水平(T0)；另一部分孔的细胞加入庆大霉素继续培养90min后，破膜涂板过夜，菌落数代表细菌侵袭水平(T90)，以T90／T0值代表细菌的侵袭力。6．AsrC高表达菌株在THP．1细胞内生存实验。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(