石蜡包埋组织切片mirna提取

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1、石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒(DP502)操作指南天根生化科技(北京)有限公司版本号:20170524实验准备1.石蜡切片或石蜡块样本2.无水乙醇,二甲苯3.移液器及配套RNase-Free无菌枪头(200μl,1ml);1.5ml,2.0ml离心管(RNase-free)4.涡旋振荡器,台式低温离心机,金属浴/水浴实验准备-试剂盒准备第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇,加入量请参见瓶上标签。在加入无水乙醇后在瓶身做好标记。Step1使用石蜡切片样本时,取切片(5-10μm使用石蜡块

2、样本时,将石蜡样品切成厚,1×1cm2大小)2-8张,刮取样本。5-10μm厚的片状,切2-8片。注意:使用石蜡块样本时,如果样品表面暴露于空气中,最初的2~3片弃掉不用。Step2迅速将切片或刮取的样本置于1.5mlRNase-free的离心管中,加入1ml二甲苯,剧烈涡旋10sec。Step312,000rpm(~13,400×g)室温离心2min,弃上清。注意:建议用移液枪吸除上清,不要吸到沉淀;不要用倾倒去除上清。Step4在上述管中加入1ml无水乙醇,涡旋混匀10sec。Step5室温(

3、15-25℃),12000rpm(~13,400×g)离心2min。用枪头吸除上清,小心不要吸到沉淀用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇。Step6打开管盖,室温(15-25℃)或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全。残余的乙醇会对RNA产生影响。Step7加入150μl裂解液RF以及10μlProteinaseK于沉淀中,彻底涡旋混匀。Step855℃孵育15min之后80℃孵育15min。Step9冰上放置3min,12,000rpm(~13,400×g)离心15min,转移上清至新的2ml

4、RNase-Free离心管中。Step10加入16μl的RDD颠倒混匀室温放置15min和10μl的DNaseIStep11加入320μl缓冲液RB涡旋混匀Step12加入1120μl的无水乙醇涡旋混匀(可能会出现沉淀)Step13and14转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12,000rpm(~13,400×g)离心1min,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。Step14重复步骤13直到所有溶液完全通过吸附柱CR3,弃废液,将吸附柱CR3放回收集管中。Ste

5、p15and16向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液室温静置2min,室温12,000rpmRW(请先检查是否已加入乙醇)(~13,400×g)离心30-60sec,弃废液。Step16重复步骤15一次Step17将吸附柱CR3放入2ml收集管中,室温12,000rpm吸附柱CR3室温放置2-5min(~13,400×g)离心2min,去除残余液体。彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。Step18将吸附

6、柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-FreeddH2O,室温放置2min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min。洗脱缓冲液体积不应少于30μl,体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存,以防降解。

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