石蜡包埋组织切片miRNA提取

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1、石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒(DP502)操作指南天根生化科技（北京）有限公司版本号：20170524实验准备1.石蜡切片或石蜡块样本2.无水乙醇，二甲苯3.移液器及配套RNase-Free无菌枪头（200μl，1ml）；1.5ml，2.0ml离心管（RNase-free）4.涡旋振荡器，台式低温离心机，金属浴/水浴实验准备-试剂盒准备第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。在加入无水乙醇后在瓶身做好标记。Step1使用石蜡切片样本时，取切片（5-10μm使用石蜡块样本时，将石蜡样品切成厚，1×1cm2大小）2-8张，刮取样本。5-10μm厚

2、的片状，切2-8片。注意：使用石蜡块样本时，如果样品表面暴露于空气中,最初的2~3片弃掉不用。Step2迅速将切片或刮取的样本置于1.5mlRNase-free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec。Step312,000rpm（~13,400×g）室温离心2min，弃上清。注意：建议用移液枪吸除上清，不要吸到沉淀；不要用倾倒去除上清。Step4在上述管中加入1ml无水乙醇，涡旋混匀10sec。Step5室温(15-25℃)，12000rpm(~13,400×g)离心2min。用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇。Step6打开管盖，室

3、温(15-25℃)或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全。残余的乙醇会对RNA产生影响。Step7加入150μl裂解液RF以及10μlProteinaseK于沉淀中，彻底涡旋混匀。Step855℃孵育15min之后80℃孵育15min。Step9冰上放置3min，12,000rpm(~13,400×g)离心15min，转移上清至新的2mlRNase-Free离心管中。Step10加入16μl的RDD颠倒混匀室温放置15min和10μl的DNaseIStep11加入320μl缓冲液RB涡旋混匀Step12加入1120μl的无水乙醇涡旋混匀(可能会出现沉淀)Step13a

4、nd14转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。Step14重复步骤13直到所有溶液完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。Step15and16向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液室温静置2min，室温12,000rpmRW（请先检查是否已加入乙醇）(~13,400×g)离心30-60sec，弃废液。Step16重复步骤15一次Step17将吸附柱CR3放入2ml收集管中，室温12,000rpm吸附柱CR3室温放置2-5min(~13,

5、400×g)离心2min，去除残余液体。彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。Step18将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-FreeddH2O，室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min。洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存，以防降解。