免疫组化方法和步骤

《免疫组化方法和步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、免疫组化检测CD34+的表达1基本原理免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。威斯腾生物400-675-6758（1）1×PBS（pH7.4，2.5L=20.0157g137mMNaCl+0.499552g2.68mMKCl

2、+0.50013075g1.47mMKH2PO4+7.253337g8.1mMNa2HPO4），115℃×15min；（2）0.85%NaCl500ml=4.25gNacl+500ml三蒸水，115℃×15min；（3）4%多聚甲醛500ml=20g多聚甲醛+500mlPBS在65℃水箱中3h多，再放入4℃保存。（4）DNaseIbuffer：40mMTris-HCl（pH7.9）+10mMNaCl+6mMMgCl2+10mMCaCl2；（5）ProteinaseKbuffer：100mMTris-HCl（pH8.0）

3、+50mMEDTA；（6）DNase1（原液1000U/ml按1：99DNase1缓冲液稀释至10U/ml）；（7）DAB工作液（临用前配制，5ul20×DAB+1ul30%H2O2+94ulPBS）（8）20μg/mlProteinaseK工作液（按1：500稀释贮存液1mg/ml）。威斯腾生物400-675-6758（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。2主要仪器设备电热压力蒸汽消毒器(XDD)浙江绍兴医疗器械总厂超净工作台苏州净化设备公司TC23

4、23型CO2恒温孵箱美国SHELLAB公司恒温烤箱上海跃进医疗器械厂高速台式离心机(BACKMANCS-15R)美国Beckman公司抽滤器(AUTOSCIENCEAP-01)上海磁力搅拌器(79-1)江苏江阴科研器械厂0.22um纤维素滤膜德国BM公司0.45um混合纤维素滤膜德国BM公司1/10000电子天枰(SartoriusAC-211)德国细胞培养瓶及细胞培养板(Costar)美国细胞计数板上海医用仪器厂光学显微镜(OLYMPUSCK-40)日本倒置显微镜（OLYMPUS)日本照像系统(OLYMPUSBH-2

5、)日本切片机：德国Leica展片机：德国Leica，HI1210型烤片机：德国Leica，HI1220型3实验方法3.1载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。1.APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。2.HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的

6、Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。威斯腾生物400-675-67583.Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。3.2常用酶消化：1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、3

7、0~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），CollagenIV（IV型胶原）等。3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。3.3抗原热修复可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。3.3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，

8、蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢