酶工程复习要点(华农)

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1、酶工程:又称酶工艺，是围绕酶所特有的催化特性使其在工业、农业、医疗等方面发挥作用的应用技术。-核心问题为酶制剂的生产和应用酶稳定性:是指酶分子抵抗各种因素的影响，维持其生物活性的能力。1.热稳定性2.酸碱稳定性3.抗蛋白酶稳定性4.抗氧化剂稳定性5.抗重金属稳定性6.抗表面活性剂稳定性7.贮运稳定性半衰期:是指一定条件下（温度、pH值等）酶制剂丧失50%活力所需的时间。酶的化学组成1.单纯酶2.结合酶-酶蛋白-辅因子：酶活性中心的组成部分//连接底物和酶分子的桥梁//稳定酶蛋白的构像酶的结构特征一级结构：组成酶蛋白的氨基酸的种类、数目和排列顺序。二级结构：一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键

2、的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等结构。三级结构：在二级结构的基础上进一步进行分子盘曲形成具有一定规律的三维空间结构。四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定构像的蛋白质分子。基本键：（1）肽键：维持一级结构的基础。（2）二硫键：增加了酶分子结构的刚性和有序性。（3）氢键：维持二级结构的基础。（4）疏水键：酶分子折叠成空间结构的主要作用力。（5）离子键：对酶分子稳定性作用显著。提高酶的稳定性：a.体外改造(1)酶的固定化(2)酶的化学修饰(3)改变酶存在的微环境b.体内改造(4)遗传修饰工程(5)菌种的选育酶活力单位1.习惯单位a.在最适条件下，每分钟吸光值

3、变化0.01所需的酶量为1Ub.在最适条件下，每分钟底物转化的量或生成产物的量µmol/min2.国际单位a.在最适条件下（最适底物浓度、pH等），每分钟转化1µmol底物或生成1µmol产物所需的酶量为1个国际单位（1U）b.在最适条件下（最适底物浓度、pH等），每秒钟能使1mol底物转化为产物所需的酶量为1Kat酶活力的表示方式（1）酶的转化数（Kcat）：每一活性中心或每分子酶在单位时间内所能转化的底物分子数。（2）酶的比活力（U/mg蛋白）：指每毫克蛋白所具有的活力单位数。（3）U/g酶制剂：表示酶制剂中的酶活大小。（4）U/mL酶液：表示液体酶中的酶活大小。（5）U/g鲜重或干重

4、：表示某种材料中的酶活大小。酶活力的测定方法A.按原理分①终止法：将酶促反应进行一定时间后终止反应。②动力学法：用仪器检测酶促反应过程中光吸收、电位、黏度等的变化。B.按检测手段分①直接测定法：直接检测底物或产物的变化。②间接接测定法：将底物或产物转化成稳定可检测的物质。③酶偶联测定法：使用一指示酶，使第一个酶的产物转变成可测定的新产物。产酶菌株的要求1.不是致病菌；2.菌株不易变异和退化；3.发酵周期短，产酶量高；4.所产的酶易于分离和提取；5.对医药和食品用酶，还应考虑安全性。菌种的筛选(1)含菌样品的采集:根据目的酶作用的底物及特性。(2)富集:通过物理、化学或生物的方法使产目的酶微

5、生物大量繁殖，以利筛选(3)产酶菌株的筛选:稀释法和划线法(4)菌株的优化:提高产酶能力；减少或消灭共存的不需要的酶、色素或其他物质；变产酶菌株的代谢，使目的酶成为组成型酶，消除代谢产物及终产物对酶的阻遏。⑸菌种的保存①低温保藏②砂土保藏③液体石蜡油封法④冰冻干燥法微生物产酶的生产流程：菌种的活化→种子培养→发酵→酶的提取培养基：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基的设计原则①选择适宜的营养物质;②营养物的浓度及配比合适;③物理、化学条件适宜;④经济节约;⑤精心设计、试验比较;设计培养基应考虑的问题①培养基成分的来源及成本②水的质量③通气搅拌所需动力大小④发酵管

6、理是否方便⑤能否使微生物生长良好且产酶量高⑥后处理的难易⑦所产的酶是组成型的还是诱导型的⑧酶的生成是否受分解代谢物和产物阻遏的影响pH影响微生物产酶原因：①影响细胞中各种酶的活性和目的酶的稳定性；②影响细胞膜上的电荷；③影响培养基中某些成分分解和中间代谢产物的解离；④影响培养基的氧化还原状态。液体深层培养法1。优点设备占地面积小；生产可以自动化；生产可以机械化。2.缺点需要高度净化的无菌空气；需要密闭良好的发酵罐；需要科学合理的管道安装；需要消费大量的电力。提高酶产量的方法：常通过控制微生物的遗传功能及控制培养环境，使某种酶或代谢产物过量生产1.选育优良的产酶细胞株系a.筛选组成型酶生产菌

7、株b.筛选抗分解代谢的突变株（分解代谢物阻遏）c.筛选抗反馈阻抑突变株（末端产物阻遏）2.添加产酶促进剂3.控制阻遏物的浓度酶生物合成的模式(1)同步合成型（生长偶联型）-酶的合成与细胞生长同步(2)延续合成型-酶的合成伴随着细胞生长而开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段时间。(3)中期和成型-酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后，酶合成终止。(4)滞后合成型-酶开始合成及大量积累在细胞