clock基因对雄性小鼠生殖功能影响

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1、Clock基因对雄性小鼠生殖功能影响作者：何煊成姝婷梁鑫刘延友汪宇辉江舟王正荣【摘要】目的：通过干扰小鼠睾丸精子节律基因Clock的表达，研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响。方法：通过RNAi技术，向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达。研究干扰Clock基因后精子数量、精子活力、体外受精率和雌鼠胎仔数变化，以及对精子顶体内透明质酸酶活性、芳香基硫酸酯酶A的含量影响。结果：Clock干扰质粒在体内可影响雄性小鼠的胎仔数，但注射干扰质粒后小鼠精子计数、精子活力及体外授精率无明显变化，精子顶体内透明质酸酶活性和芳香基硫酸酯酶A含量也

2、无明显变化。结论：节律基因Clock与雄性小鼠生殖能力有密切关系。【关键词】Clock基因;RNA干扰;圆形精子;顶体9自然界中，近日节律基因广泛存在于生物体内，调控着机体的生命活动。在所有生物体内存在类似的包括Clock、Period等节律基因的转录和转录后调控所形成的分子振荡。其中Clock作为近日节律的核心基因，其表达的蛋白Clock与Bmal1形成异二聚体，在近日节律分子振荡中发挥着重要作用。近来研究发现，小鼠生精过程中圆形精子的顶体具有明显的Clock的表达[1]。而在睾丸中，Clock表达的圆形精子期是小鼠生精周期中顶体发育的关键时期[2]，利用RNA干

3、扰(RNAi)技术，干扰Clock小鼠睾丸中的表达，发现雄鼠睾丸Clock蛋白的表达明显下调，顶体酶活性明显下降，生殖功能明显下降[3]，提示节律基因Clock可能与精子的受精能力有关。本文利用RNA干扰(RNAi)技术，干扰Clock在小鼠睾丸中的表达，进一步探讨Clock基因对小鼠生殖功能影响的机制。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物SPF级ICR小鼠，雄鼠6～8w，雌鼠4～6w，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。在12L∶12D光暗循环下自由饮食，雌雄分笼饲养，标准小鼠笼具。　　1.1.2主要试剂Clock干扰质粒和阴性对照质粒(由本实验室

4、提供)，小鼠芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA检测试剂盒(Unionhonest公司生产)，其余试剂均由实验室提供。　　1.2方法　　1.2.1体内实验(胎仔数)920只雄鼠随机分为干扰组(RNAi)和对照组(Control)，每组10只。乙醚麻醉，固定双侧睾丸，分别用微量注射器将干扰质粒(干扰组)和空质粒(对照组)于双侧睾丸各注射20μl。注射后16d的13∶00-14∶00对雌鼠进行腹腔注射PMSG(孕马血清促性脉激素)，46-48h后腹腔注射hCG。雌鼠注射HCG(人绒毛膜促性脉激素)后的当天将两组雄鼠按雌雄2∶1的比例合笼。雌鼠受孕后立即处死雄鼠，测定精子数

5、量以及精子活力。合笼后受孕的雌鼠大约在21d开始产仔，分别计数每只雌鼠的胎仔数。　　1.2.1.1精子计数雄鼠处死后，立即剪开附睾尾，放置于盛有1.5mlT6(人脉巴细胞亚群分样)+15mg·ml-1BSA(牛血清白蛋白)培养基的表面皿中，37℃、5%CO2孵箱预平衡过夜。随后将附睾尾剪成四段，在37℃、5%CO2孵箱中孵育30min，让精子充分游出，立即计数精子数量。　　1.2.1.2精子活力精子从附睾尾释放出来2～4h内，在高倍镜下观察5～10个视野，计数100个精子并进行分级。精子活力分为4级，快速前向运动为+++、慢而呆滞的前向运动为++、非前向运动为+、原

6、地不动为-。　　1.2.2体外受精(IVF)取20只4～6w雌鼠，以48h间隔腹腔注射PMSG10IU和hCG10IU诱发超排卵，注射hCG后15～16h处死小鼠，立即开腹取出输卵管，放进0.5mlT6+20mg·ml-19BSA培养皿内，在解剖镜下用解剖针撕开膨大的壶腹部，将卵丘细胞包围的合子团释放出来。将合子在透明质酸酶溶液中放置到卵丘细胞脱掉为止。用移卵管将合子收集并转移到含新鲜的M2培养液中，洗几次以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞以及杂质。然后将合子转移到微滴培养皿中，用平衡好的培养液洗涤3次后，转入事先在37℃、5%CO2孵箱预平衡过夜T6+20mg·ml

7、-1BSA受精滴中，并准确计数加入到每个受精滴中卵细胞数。把4～10μl孵育过的干扰组和对照组的小鼠精子悬浮液分别加入到含有卵丘卵母细胞复合体的受精滴中，精子浓度为1×106·ml-1左右。将培养皿中加入精、卵细胞的受精滴放回37℃、5%CO2孵箱保持孵育5～6h。用200倍倒置显微镜观察并计数两组20个受精滴中的二细胞数量，即受精卵的数量，评价精子的体外受精率。　　1.2.3Clock干扰质粒对顶体内的酶的影响　　1.2.3.1透明质酸酶活性检测[4]　　在同时注射干扰质粒和空质粒18d后，分别处死两组小鼠，摘除附睾尾，在PBS中去除附着在附睾上的脂肪，立即放