hvegfa基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

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1、hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究作者：李慧勇，袁志诚，陈波，陆培松，李巧玉，曹侃【摘要】目的：应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体。方法：采用分子克隆技术，从PCR2.1hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列，酶切、连接后，插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrackCMV，获得重组质粒pAdTrackCMVhVEGFA，将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy1的大肠埃希菌BJ5183，进行同源重组，获得重组子pAdeasy1hVEGFA。鉴定后,将pAdeasy1hVEGF

2、A转染人胚肾细胞(HEK293A细胞)，获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAdhVEGFA)。反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒，50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度，荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果：成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达，证明腺病毒载体rAdhVEGFA转染成功，通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒。结论：成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。【关键词】hVEGFA基因

3、;腺病毒载体;转染;缺血性脑血管疾病12　[Abstract]Objective:ToconstructtherecombinantadenovirusvectorcontaininghVEGFAgene.Methods:ThehVEGFAgenecodingsequencewasclonedintopAdTrackCMVplasmidtogetpAdTrackCMVhVEGFA,whichwouldbetransformedintocompetentE.coliBJ5183carriedbackboneplasmidpAdeasy1already.Thehom

4、ologousrecombinantadenoviralplasmidwasdeliveredintoHEK293Acellsafterverification.Theidentifiedrecombinantadenovirus(rAdhVEGFA)wasamplifiedinHEK293Acells.ViralparticleconcentrationwasdeterminedbyTCID50.Results:Therecombinantadenovirusvectorwasconstructedsuccessfully.TheexpressionofGFPwas

5、observedandtherightgenewasfound.Conclusion:TherecombinantadenoviralvectorcarryinghVEGFAgenewassuccessfullyconstructed,andprovidedthebasisofischemiccerebrovasculardisease′sgenetherapy.　　[Keywords]hVEGFAgene;adenovirusvector;transfection;ischemiccerebrovasculardisease(ICVD)　　血管内皮生长因子(vascu

6、larendothelialgrowthfactor,VEGF12)是Ferrara等在1989年从牛垂体滤泡星状细胞的条件培养基中纯化出来的一种具有肝素结合活性的生长因子,是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异性的有丝分裂原,能特异性地作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖[1]。　　VEGF治疗缺血性脑损伤的研究具有重要的现实意义。本实验利用重组腺病毒载体AdEasy系统构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，以为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。　　1材料与方法　　1.1材料和试剂　　PCR2.1hVEGFA质粒由青岛海

7、洋研究所惠赠。TaKaRaTaqTM、pMDTM18T载体和T4DNA连接酶(TaKaRa公司);穿梭质粒pAdtrackCMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy1、大肠埃希菌DH5α菌和BJ5183及HEK293A细胞由江苏大学医学技术研究所保存;BglⅡ、XhoⅠ(TaKaRa公司);PmeⅠ、PacⅠ(NEB公司)，质粒大、小量制备试剂盒(AxyPrep公司);Lipofectamin2000(Invirogen公司)。　　1.2方法　　1.2.1目的基因hVEGFA的克隆12　　上海生工生物技术有限公司合成引物，P1:5′CG