小鼠cgrp基因重组腺病毒载体的构建

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1、浙江大学2008年医学硕士研究生论文CGRP基因重组腺病毒载体的构建浙江大学医学院心血管内科学硕士研究生邵蕾指导老师郑良荣摘要目的:利用AdEasy腺病毒载体系统，构建并鉴定小鼠降钙素基因相关肤基因(calcitoningene一relatedp印tide，CGRP)重组腺病毒载体。方法:采用RT一PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段并与PUCS:重组，经测序验证无误后，将小鼠CGRp基因亚克隆至穿梭质粒pshuttle一CMV上。在大肠杆菌BJS183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy一1进行同源重

2、组产生重组腺病毒质粒，经过抗性筛选以及酶切鉴定得到阳性的重组质粒在XL一Gold细胞中扩增。然后在人胚肾293细胞中进行重组腺病毒的包装扩增，并经氯化艳纯化得到重组腺病毒AdEasy一Shuttle一CGRP。结果:测序证实PUCS:一CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pshuttle一CMV一CGRP经双酶切鉴定后可见约7.skb和423bP片段;重组腺病毒质粒浙江大学2008年医学硕士研究生论文AdEasy一Shuule一CG即经Pacl酶切可见长约3.0·kb与30.0kbDNA片断

3、。转染人胚肾293细胞7d后可见细胞出现病变效应，回收病毒可以重复感染293细胞，并且提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性。结论:成功构建了携带CGRP基因的重组腺病毒载体，为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础。关键词:降钙素基因相关肤，腺病毒载体系统，重组，基因治疗浙江大学2008年医学硕士研究生论文ConstruCtionofRecombinantAdenovirusVeetorofCGRPABSTRACTAIM:TodevelopagenetheraPyveetorofealciton

4、ingene一relatedP叩tide(CG好)usingreeolllbinantadenovirus.METHODS:RT一PCRwasPerformedtogetfull一lengtheDNAofCGRPgene.ThegenewasthenelonedintothePUC57andPshuttle一CMVshuttleveetor，reSPeetively.Afterline如zationwithPmel，thereeombinantPlasmid印shuttle一CMV一CG即)wastransforme

5、dintoE.eoliBJS183cellsbyeleetroPorationtoeonstructthehomologousreeombinationofAdEasy一Shuttle一CGRP.Theline如zedreeombinantPlas而dswereusedtotransformXL10一GoldultraeomPetenteellsandtherecombinantadenovimsPlas而dDNAeanbe田的Plified.ThenthereeombinantPlas而dwastransfeete

6、dinto293eells.RESULTS:TheRT一PCRProductwasconfirmedafull一lengtheDNAofCGRPinPUCS:by浙江大学2008年医学硕士研究生论文sequeneing.TheeorresPoedingdoubleendonueleaseandPCRanalysiseertifiedthesueeessfuleloningofthegeneintothePshuttle一CMV.ThereeombinantsofAdEasy一Shuttie一CGRPwereselee

7、tedforresistaneeanddigestedbyPae1endonucleasetoformthet即icalsegments，whoselengthwasabout3kband30kb.Thetransfeetedeellsshowevideneeofaeytopathieeffeet(CPE).RestrietionendonueleaseandPCRanalyseseonfinnedthattheCGRPgenewassuecessfullyinsertedintotheadenovirusvecto

8、rwithverystrongPoweroftransfeetion.Thetiterofthereeombinantedenovimswas5x108PFU/ml.CONCLUSION:ThereeombinantadenovirUsvectorofCG即genewassuceessfullyeonstructedbythemethodofh