生物学实验 血液基因组dna 的纯化分离

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1、实验5血液基因组DNA的纯化分离【实验目的】掌握动物全血基因组DNA提取的方法【实验原理】真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，而成熟的红细胞除禽类外没有细胞核，因此，制备DNA的原则是先要分离白细胞。提取DNA的一般过程是将分散好的白细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。【器材与试剂】1．器材制冰机、冰箱、冷冻低温超速离心机、常温高速离心机、移液器，旋转摇床、恒温箱、恒温水浴箱、离心管架、真空干燥器、烧杯、试

2、剂瓶、离心管和　吸头等。2.试剂(1)PBS-缓冲液：取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，定容至1000ml，高压灭菌(2)提取液：含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.1mol/LEDTA，0.5%(m/V)SDS。(3)20mg/ml蛋白酶K溶液(4)平衡酚(5)氯仿(6)10mol/L醋酸铵(7)无水乙醇(8)70%(V/V)乙醇(9)TE缓冲液【操作步骤】1.冰冻的血样在室温水浴中融化。2.10ml全血转入一个无菌的50ml离心管中。3.加入1倍体积的PBS缓冲

3、液并混匀稀释。1.室温下，以3,500g的相对离心力，离心15min。2.弃去上清液。3.沉淀物中加入3.5ml提取液使其悬浮。4.然后37℃水浴1h。5.加入25μl20mg/ml的蛋白酶K，在60～65℃的恒温箱中保温3h。6.加入1倍体积的酚(pH8.0)，放旋转摇床口底晃动10～30min，以5,000g的相对离心力，在4℃下离心20min。7.水相移到一个无菌干净的离心管中。8.加入0.5倍体积的酚和0.5倍体积的氯仿，翻转摇动10min，4℃下，以5,000g的离心力，离心15min。9.水相移到一个无菌干净的离心管中

4、。10.加入1倍体积氯仿，翻转摇动10min，4℃下以5,000g的离心力度，离心15min。11.水相用移液器移到一个无菌干净的离心管中。12.加入0.2倍体积醋酸铵，放置冰上。13.加入2倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻翻转摇动，然后冰上放置10～30min，直到DNA析出。14.用一玻璃钩将白色DNA团钩出放进一个1.5ml的离心管，加入500μl70%乙醇并晃动，以5,000g的离心力，离心3～5min，弃去乙醇，空气干燥。15.根据DNA的量，加入500～1000μlTE－缓冲液，保存于4℃过夜，使其完全溶解，分光光度计测定浓

5、度后，－80℃保存。【思考题】动物基因组DNA提取的原理是什么？【参考文献】ChenH,LeibenguthF.RestrictionendonucleaseanalysisofmitochondrialDNAofthreefarmanimalspeciescattle,sheepandgoat.Comp.Biochem.Physiol.1995,111B:643-649