中华绒螯蟹表达序列标签(est)分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究

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5、fatal,whennightcame【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国的重要增养殖对象之一。近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的提高,由细菌、病毒和类立克次体生物等引起的各种病害日趋严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的损失。至今,病害仍然是困扰其养殖业的一个重要因素。除改善环境因素外,提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一难题的一个重要方法。本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的免疫防御机制,以其为这一重要方法提供坚实的理论基础。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建和表达序列标签(EST

6、)的分析,不仅丰富了中华绒螯蟹的基因数据,同时筛选出许多与免疫相关的基因序列。在此基础上,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和实时定量PCR技术进一步对主要的免疫相关基因进行了克隆和表达模式分析,这些研究为了解中华绒螯蟹免疫机制提供了基础资料,同时也为蟹病的防治提供了新思路。主要研究结果如下:1采用常规cDNA文库构建技术,成功构建了滴度为4.50×10~6CFU/mL,库容为3.3×10~6CFU/mL,重组率为73%的中华绒螯蟹血细胞cDNA文库;从文库中随机挑取了3,118个克隆进行5’-端单向测序,经去除低质量和污染序列后,共得到3,041条高质量EST序列,这

7、些序列的平均长度为561bp。经拼接后获得了1,049条unique序列,包括292条重叠群(Contig)和757条单一序列(Singleton)。通过比对发现有488条Unique序列被注释成已知的功能基因,551条Unique序列未被注释任何功能;通过GeneOntology功能分类发现了26个中华绒螯蟹先天性免疫反应,如参与酚氧化酶系统的丝氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,参与凝集反应的谷胱酰胺转移酶,与抗氧化系统相关的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽