稳定表达EGFRvⅢ胶质瘤细胞株的建立

《稳定表达EGFRvⅢ胶质瘤细胞株的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码10459学号或申请号201512524294密级公开硕士学位论文稳定表达EGFRvIII胶质瘤细胞株的建立作者姓名：雷舒婷导师姓名：韩双印学科门类：医学专业名称：临床医学培养院系：郑州大学人民医院完成时间：2018年5月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEstablishmentofGliomaCellLinewithStableExpressionofEGFRvIIIByShutingLeiSupervisor:Prof.ShuangyinHanInternalmedic

2、inePeople’sHospitalofZhengzhouUniversityMay2018学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的

3、复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日稳定表达EGFRvIII胶质瘤细胞株的建立研究生雷舒婷导师韩双印郑州大学人民医院河南郑州450003摘要目的脑胶质瘤是成人最具侵袭性的恶性脑瘤，尽管传统治疗方式取得了一些进展，其难治性仍是临床困扰的问题，大量临床前实验及临床实验证实，免疫疗法是一种

4、能够靶向杀伤肿瘤组织的特异性治疗手段。以表皮生长因子受体III（EpidermalgrowthfactorreceptortypeIII,EGFRvIII）为靶点的嵌合抗原受体（Chimericantigenreceptor,CAR）T细胞过继免疫疗法是治疗GBM的高效手段。与EGFR完整结构想比较，EGFRvIII的第二、第三、第四、第五、第六、第七个外显子被删除，导致801个碱基对的缺席，从而形成了新的甘氨酸密码子。在被翻译之后，胞外区6~273氨基酸被一个甘氨酸残基替代，最终形成了EGFRvIII，其特点是在正常组织中不表达，仅在肿瘤细胞中出现[1]，而且

5、是一种在包括脑胶质瘤在内的多数肿瘤中表达率极高的肿瘤特异性抗原，与肿瘤的许多恶性表型的出现密不可分，因此可当做合适的肿瘤治疗靶标，目前已经成为备受瞩目的肿瘤靶向治疗的分子靶点。EGFRvIII作为一个分子靶点，为胶质瘤的靶向治疗提供了新思路，本论文中构建的稳定表达EGFRvIII的U87细胞株，为胶质瘤的靶向治疗提供研究基础。方法首先EGFRvIIIcDNA（2832bp）克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puroI的XbaI和NotI位点，引物中添加His6标签,测序鉴定；用磷酸钙沉淀法将含目的基因的质粒pCDH-CMV-EGFRvIII-EF1-pur

6、o与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.9和包膜蛋白质粒pVSV-G三质粒共转染293T细胞。过滤、浓缩包装好的病毒后，利用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的慢病毒感染U87细胞，嘌呤霉素筛选、有限稀释克隆培养建立稳定表达细胞株。Westernblot采用人EGFRvIII单抗、His6单抗检测筛选的细胞株,流式细胞术检测EGFRvIII在U87细胞表面的表达。结果重组质粒pCDH-EGFRvIII经XbaI和NotI双酶切、1%琼脂糖凝胶电泳，产物与预期目的基因EGFRvIIIcDNA（2832bp）大小一致；Westernblot鉴定6株U87-vIII均表达EG

7、FRvIII蛋白(145kd)和His6(145kd)；流式细胞术检测2株U87-vIII细胞株（U87-vIII-2,U87-vIII-4）表面均表达EGFRvIII蛋白（分别为93.1%和96.9%）。结论稳定表达EGFRvIII的U87细胞株被成功建立,为胶质瘤靶向治疗研究提供了基础。关键词表皮生长因子受体Ⅲ型突变体脑胶质瘤U87IIEstablishmentofGliomaCellLinewithStableExpressionofEGFRvIIIByShutingLeiSupervisor:Prof.ShuangyinHanPeople’sHospit

8、alofZhengzho