猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白B细胞表位和T细胞表位的初步筛选

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1、学校代码10459学号或申请号201512162006密级公开硕士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白B细胞表位和T细胞表位的初步筛选作者姓名：张阳导师姓名：王爱萍教授学科门类：理学专业名称：细胞生物学培养院系：生命科学学院完成时间：2018年5月Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterIdentificationofB-cellepitopesandT-cellepitopesinGlycoprotein3ofporcinereproductivean

2、drespiratorysyndromevirusByYangZhangSupervisor:AipingWangMajor:CellBiologySchoolofLifeSciencesMay,2018学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务

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4、呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一种传染病，可引起母猪的繁殖障碍以及不同年龄猪的呼吸疾病，给全世界的养猪产业造成了严重的经济损失。由于PRRSV存在抗体依赖性增强作用、高度变异性以及持续性感染等特点，因此，现有的商品化疫苗并不能完全保护猪群免受病毒侵害。研究显示，PRRSV可以诱导机体产生B细胞和T细胞免疫应答，而GP3蛋白作为一个次要结构蛋白在病毒的复制、装配、变异和致病性方面具有重要的作用。因此，本研究利用ELISA和ELISPOT等试验方法筛选GP3蛋白的2

5、个B细胞表位肽段和3个T细胞表位，为研发防治PRRSV的疫苗提供理论基础和数据支持。使用JXA1-R毒株对试验组的5头猪进行免疫，对照组的3头猪按照同样的方法注射MARC-145细胞的培养上清。首免后每周采血并分离血清，首免12周以后大量采血并分离外周血单核细胞。通过ELISA和Real-TimePCR方法分别检测试验动物血清中N蛋白抗体和病毒载量水平。ELISA结果显示，首免后1周即能在试验动物血清中检测到N蛋白抗体，并且在2~3周达到峰值，随后趋于平稳并持续存在；Real-TimePCR结果显示，首免后1~2周血清中病毒载量达到峰值，之后下降，在加强免疫

6、后2~3周血清中的病毒载量又明显上升，随后从首免后第6周开始下降。根据GP3蛋白的28~254位氨基酸序列设计并合成24条含有9个氨基酸重叠长度为18个氨基酸的多肽。使用ELISA方法筛选B细胞表位，将合成的24条多肽分别作为包被抗原，检测其与试验动物血清中抗体的免疫反应性，结果显示GP3蛋白B细胞免疫显性表位主要分布于N端第46~99位氨基酸，其中4号肽：P55LCPTRQAAAEILEPGKS72和7号肽：C82SENDHDELGFMVPPGLS99具有更强的免疫反应性；使用ELISPOT方法筛选T细胞表位，经过两轮试验后筛选得到3条阳性多肽，分别为10

7、号肽：A109WLAFLSFSYTAQFHPEI126、13号肽：Y136VDIKHQFICAVHDGDNA153和24号肽：L235GMATRPLRRFAKVLSAA252。随后，将筛选得到的B细胞表位肽段和T细胞表位与21株PRRSV毒株GP3蛋白的相应氨基酸序列用DNASTAR进行比对，I分析其同源性。结果显示，本试验筛选到的2个B细胞表位肽段（4号肽和7号肽）与北美洲型毒株相比其同源性分别为84%和90%。3个T细胞表位（10号肽、13号肽和24号肽）与北美洲型毒株相比其同源性分别为99.7%、78%和66%。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3结构

8、蛋白T细胞表位B细胞表位ELISPOTIIAbstr