猪繁殖与呼吸综合征病毒m蛋白b细胞线性表位的鉴定及其与宿主蛋白相互作用

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分类号：单位代码：密级学号：博士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定及其与宿主蛋白相互作用研究生：王倩匕十日寸教师：杨汉春教授合作指导教师：田志军研究员申请学位门类级别：农学博士专业名称：预防兽医学研究方向：动物分子病毒学与免疫学所在学院：动物医学院 Ph.DDissertationIdentificationoflinearBcellepitopesonPRRSVMproteinanditsinteractionwithhostproteinPh.D.Candidate:QianWangSupervisor:ProfessorHanchunYangDr.ZhijunTianMajor:PreventiveVeterinaryMedicineResearchField:MolecularVirology&ImmunologyChinaAgriculturalUniversityMay,2015 本研究受国家自然科学基金（资助 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：上年月曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：養时间：丨年月円 摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒（是严重危害养猪业的病原。的非糖基化蛋白是最保守的结构蛋白，在病毒粒子中蛋白和以二硫键相连形成的异源二聚体是感染必须的。本研究通过制备蛋白单克隆抗体，鉴定其识别的表位，筛选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，进一步分析蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用及其对复制的影响，以期为揭示蛋白在感染与免疫中的生物学功能提供科学依据。用超速离心纯化的免疫周龄雌性小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合。利用间接免疫荧光试验（筛选阳性杂交瘤细胞，经亚克隆获得株分泌抗蛋白单克隆抗体（的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为和，其效价均能达到。亚类鉴定结果表明，和分别为和亚类。分析显示，株单抗均能与蛋白特异性结合。阻断分析表明，和与的反应能被阳性血清阻断。利用制备的株蛋白单克隆抗体，对蛋白进行了抗原表位的鉴定。首先将蛋内截短为相互重叠的段，进行分析。结果显示，单克隆抗体识别单克隆抗体识别进一步对这两段分别截短为段，最后经寡核苷酸直接退火连接到表达载体进行表达，结果显示识别蛋白的，识别蛋白的研究结果表明，单克隆抗体和识别的表位为首次确认的蛋白线性表位。氨基酸序列比对显示，鉴定的个表位在基因型毒株中高度保守，而在基因型毒株中存在缺失和突变。利用蛋白单克隆抗体，采用免疫共沉淀（结合串联质谱（方法，筛选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，并对筛选出的细胞蛋白进行生物信息学分析。结果表明，与对照组相比，感染组共存在条差异表达的蛋白条带，将条蛋白胶条带进行串联质谱分析，鉴定出个（与蛋白相互作的宿主蛋白，这些蛋白主要与蛋白翻译、病原致病、信号传导等细胞通路存在密切的关系。将分别携带和的真核表达载体共转染细胞，利免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证了蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用和共定位情况。将感染细胞，利用蛋白单克隆抗体进行免疫共沉淀，在免疫复合物中也能检测到蛋白，表明蛋白和蛋白在病毒感染情况下也具有相互作用。利用沉默细胞中基因的表达后，再感染釆从和病毒滴度测定分析对增殖的影响。结果表明，抑制的表达能降低子代病毒的产量和病毒蛋白的表达，提示宿主细胞蛋白参与的复制。综上所述，本研究鉴定出存在于蛋白的个新表位和，筛选山与蛋白互作的宿主细胞蛋白，并绘制出蛋白互作图谱，证实了蛋白与宿主细胞蛋白具有相互作用，并揭示了在增殖中的生物学意义。研究结果丰富了蛋白的抗原结构，并为深入研究蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的分子机制及其生物学意义提供了重要依据。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，蛋白，单克隆抗体，表位，，相互作用 AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isregardedasanimportantpathogenimpactingontheswineindustryworldwide.TheMprotein，，，，， HEK293TcellswerecotransfectedwiththeeukaryoticexpressionvectorscarryingHuN4-F112-MandNF45ORFs，， 目录目插图和附表清单主要符号表第一章引言国内外研究现状研究的目的及意义研究内容与技术路线猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋细胞线性表位的鉴定与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作州的宿主蛋白的筛选与分析猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用及对病毒增殖的研究目标第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定引言材料与方法实验材料实验方法分析病毒的纯化及鉴定细胞融合及杂交瘤细胞株的筛选杂交瘤细胞的染色体鉴定单克隆抗体特性的鉴定单克隆抗体的纯化讨论第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定引言材料方法实验材料实验方法结果与分析及其截短片段的扩增 3.3.2各基因片段原核表达载体的单、双酶切及鉴定单克隆抗体和识别蛋白表位的鉴定不同毒株蛋白的氨基酸序列对比分析舰第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与分析弓言材料方法实验材料实验方法结果分析与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的筛选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的质谱鉴定与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的生物信息学分析讨小结第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影引言材料与方法实验材料实验方法结果与分析真核表达载体的构建免疫共沉淀验证蛋白与在细胞中的相互作用激光共聚焦验证蛋白与在细胞中的相互作用感染对表达的影响干扰对增殖和蛋白表达的影响过表达对增殖的影响、结第六章结论第七章创新点第八章文献综述猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要结构蛋白 8.2.2GP5788.2.3M798.3NF45的研究进展的结构研究进展的功能研究进展蛋白质相互作用的主要研究方法酵母双杂交技术免疫共沉淀技术参考文献致谢作者简历 插图和附表清单插图清单图超速离心的的及分析图蛋内单克隆抗体和与、疫苗株和表达蛋内的细胞的反应图株杂交瘤细胞的染色体鉴定图分析抗蛋白单克隆抗体的特异性图单克隆抗体效价的测定图阳性血清阻断蛋白单克隆抗体与病毐的结合图单克隆抗体的纯化（及分析（图及其截短片段的扩增图重组表达载体的酶切及鉴定图重组表达载体的酶切及鉴定图蛋白及其截短片段的抗原性鉴定图单克隆抗体和识别抗原表位的氨基酸序列比对图与蛋白互作的宿主蛋白的及分析图与蛋白互作宿主细胞蛋的功能注释分析图蛋白互作宿主细胞蛋白的通路分析图与蛋白互作宿主细胞蛋的互作图谱图的扩增及重组质粒的鉴定图免疫共沉淀验证蛋白与的相互作用图蛋白与在细胞中的共定位分析图感染细胞中表达分析图干扰对增殖和蛋白表达的影响图过表达对增殖的影响图的结构【图锌指结构域的二聚体结构图和相互作用模型【 附表清单表单克隆抗体的类型鉴定表本文引用的表的扩增引物及其截短表达引物表与蛋白相互作用的宿主蛋白表与蛋白互作宿主细胞蛋白的通路分析表真核表达载体构建所用引物表的序列 主要符号表缩写英文名称中文名称氨基酸乙腈抗体依赖性增强作用氨节青霉素抗原反应识别原件二辛可宁酸巯基乙醇碱基对卜病毒性腹湾病毒互补米免疫共沉淀细胞病变天二脒搖苯基丨噪丨改进的培养基二甲基亚砜脱氧核糖核酸三憐險脱氧核糖核佳二巯基苏糖醇锌指结构域马动脉炎病毒乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验正向胎牛血清异硫氰酸突光素克或离心力单位憐酸油醒脱氧嗨小时两型肝炎病毒辣根过氧化物酶人鼻病毒喷哚乙酸免疫焚光试验免疫球蛋白丨白细胞介素介素增强了结合因子 IPTGisopropy-p-D-thiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷内部核糖体进入位点千碱基对千道尔顿升乳酸脱氢酶增高症病毒毫升克米摩尔每升）单克隆抗体微分钟感染复数信使纳米克）硝酸纤维素核输出信号活化细胞核因子活化细胞核因子活化细胞核因子核定位信号核仁定位信号非结构蛋白光密度开放阅读框概率聚丙烯酰胺凝胶电泳肺泡巨噬细胞磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚乙二醇依赖于的蛋白质激酶皮摩尔苯甲基磺酰氟多聚蛋白猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征病毒脊髓灰质炎病毒聚偏氟乙烯反向转分钟核糖核酸干扰核糖核酸酶反转录 ssecond秒十二烷基硫酸钠猴出血热病毒细胞培养条件下稳定同位素标记技术小干扰精了细胞的核结合蛋白半数组织（细胞）感染量四甲棊乙二胺三氟乙酸，’，’叫巾基联苯胺单位微升克米摩尔每升）非翻译区伏特锌指结合蛋山 中国农业大学博士学位论文第一章引言第一章引言猪繁殖与呼吸综合征（是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，临床表现主要以妊娠母猪流产、早产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征丨。该病于年首次在美国发现，年在德国暴发，随后蔓延至欧洲各国【】。随后几乎在全球所有养猪的国家和地区流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失】》我国于世纪年代中期发生该病其后广泛地流行于全国各地，并成为我国养猪生产中母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病的主要疫病之一。年，我国出现和流行以编码区缺失个氛基酸为分子特征的高致病性，并导致严重型的暴发，感染猪群山现高发病率和高死亡率，给我国养猪业造成了不可估量的经济损失，弓丨起了国务院和农业部以及国外的高度关注国内外研究现状猪繁殖与呼吸综合征病毒（是的病原】，归类于套式病毒目、动脉炎病鸾科、动脉炎病毒属同属的成员还有马动脉炎病毒（、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（和猴出血热病毒（，。基于血清学和基因组序列的差异，分为以欧洲型毒株为代表的基因型和以美洲型毒株为代表的基因型。虽然这两种基因型的毒株感染所致疾病的临床特征基本一致，但两者在基因组、抗原性等方面存在明显差异火量的研究结果表明，基因组变异现象在同型毒株之间非常普遍一方面与病毒基因组本身的复制特性以及具有准种特征有关】，另一方面与不同毒株间的重组有关【，，从而导致毒株具有多样性变异的复杂性丨。的基因组为不分节段的单股正链，全长约，具有帽子结构和尾’’端和’端各含有一个非编码区（至少含有个幵放阅读框（包括、、、、和最近发现的。的和共占基因组的，是病毒基因组的非结构蛋白编码区，编码病毒的复制酶多聚蛋白攻和多聚蛋白通过自剪切产生至少种非结构蛋白（、、、、、以及最近发现的。编码病毒的结构蛋白，由亚基因组表达其中蛋白负责包裹病毒还有几种膜蛋白嵌入病毒的囊膜中，包括糖基化蛋白（、、和、非糖基化蛋白（和和新发现的蛋白。在结构蛋白中，、和是病毒粒子的主要成分，、、和是病毒的次要结构蛋白，可能是病毒非常次要的成分以二硫键相连形成异源三聚体，而与形成异源二聚体】。有研究表明，用免疫电镜可以观察到不同毒株的病毒粒子表面的蛋白，分析也证实了存在于病毒粒子表面，并显示出了的不同亚型，因此推测有可能作为一种结构蛋白参与病毒粒子的组成蛋白是一种型跨膜蛋白，分子量为基因型）或基因型），由一个次连续的跨膜区、个氨基酸的胞外区和个氨基酸的胞内区构成丨，它只 中国农业大学博士学位论文第一章引言有个氨基酸残基暴露在病毒粒子表面。蛋白是非糖基化的结构蛋白，是动脉炎病毒最保守的蛋白在病毒的装配和出芽过程中发挥着重要作用，】》在病毒粒子中，蛋白和蛋白以异源二聚体的形式存在，这对于动脉炎病毒的感染性是必须的并且在有助于稳定与受体结合的病毒吸附位点。】。而且蛋白的存在有助于诱导细胞免疫反应和产生中和抗体。结构蛋白与宿主细胞受体的相互作用研究表明，异源二聚体中的蛋白和蛋白是通过结合细胞的硫酸乙醜肝素从而吸附细胞丨病毒的内化则是通过复合物结合巨唆细胞上的唾液酸粘附素以及和结合完成的丨。近年来，与宿主蛋白相互作用的研究已成为国内外学者竞相研究的热点。的致病机制十分复杂，从的结构蛋白与宿细胞主蛋白之间的相互作用入手，不但对于阐明与宿主细胞相互作用的分子机制具有重耍的科学价值，也有可能为解释其致病性机制提供有力的科学依据。蛋白作为的主耍结构蛋白，具有很强的免疫原性，在病毒的入侵与感染细胞以及宿主对病毒的免疫应答中具有十分重耍的作用。本研究以高致病性疫苗株】为材料，着眼于蛋白，鉴定其细胞线性表位，并分析蛋内与宿主细胞蛋白的相互作用及其生物学意义，以期为深入研究蛋内在致病机制以及诱导宿主免疫反应中的生物学功能奠定基础。研究的目的及意义本研究旨在制备蛋白单克隆抗体的基础上，鉴定单克隆抗体识别的蛋白细胞线性表位；蹄选和分析与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，进一步探讨宿主细胞蛋白与蛋白相互作用的生物学意义，为深入理解蛋内在感染与免疫中的生物学功能提供必要的科学依据。研究内容与技术路线猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备利用超速离心纯化的免疫小鼠，采用细胞融仓技术制备细胞杂交瘤细胞，经间接免疫焚光试验蹄选能稳定分泌抗蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并对细胞株和单克隆抗体进行鉴定。技术路线如下： 中国农业大学博士学位论文第一章引言纯化免疫小鼠】‘‘‘细胞融合及筛选■阳性杂交瘤细胞的克隆细胞和单抗的扩火培养‘细胞和单抗的鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定利用制备的蛋白单克隆抗体，采用分段重■表达技术鉴定单克隆抗体所识别的蛋内抗原表位，将鉴定的抗原表位勾已发表的不同毒株的蛋白氨基酸序列进行比对，分析其变异情况。技术路线如下：构建表达的原核表达载体“扩增蛋白截短片段【构建各片段原核表达载体诱导表达■■分析序列比对 中国农业大学博士学位论文第一章引言与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析用感染细胞，利用蛋白单克隆抗体，采用免疫共沉淀结合串联质谱（的方法蹄选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，并通过生物信息学方法分析蹄选出的宿主细胞蛋白。技术路线如下：■“接种细胞‘‘免疫共沉淀考染、挖取差异条带质谱鉴定生物信息学分析‘■“猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用及对病毒增殖的影响利用免疫共沉淀和激共聚焦技术验证蛋内与宿主细胞蛋白之间的相互作用，采用干扰和慢病毒包装技术特异性地沉默成增加基因的表达，通过和分别检测病毒感染后病毒蛋白的表达和培养上清中病毒的含量，分析对病毒增殖的影响。技术路线如下：、蛋白与宿主蛋白的相互作用及对病毒增殖的影响相互作用的验证干扰过表达试验“入、人人■‘免激慢■囊靈 中国农业大学博士学位论文第一章引言研究目标制备出稳定分秘抗蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，鉴定出单克隆抗体识别的蛋白细胞线性表位。蹄选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，绘制出蛋白与宿主细胞蛋白的互作图谱。确定蛋白与宿主蛋白的相互作用，并揭示其对病毒增殖的影响。 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定摘要：用超速离心纯化的免疫周龄小鼠，将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用间接免疫焚光试验（蹄选阳性杂交瘤细胞，经亚克隆获得株可分泌抗蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为和。结果显示，单克隆抗体能够识别基因型的及疫苗株】、和而不能识别基因型的和株；单克隆抗体能够识别基因型的及疫苗株丨、、和基因型的而不能识别基因型株。亚类鉴定结果显示，为丨为。株单克隆抗体的效价均达到。分析显示，株单克隆抗体均能与的蛋白特异性结合。阻断分析表明，和与的反应能被阳性血清阻断。该研究为检测技术的建立及其相关基础研究提供了物质基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，蛋白，单克隆抗体引言’猪繁殖与呼吸综合征病毒（是危害养猪生产的重要病原，其基因组为单股正链不分节段，全长大约，含有至少个开放阅读框（〉，包括、丨、、、和。结构蛋白编码区仅占基因组全长的，其中编码病毒的囊膜糖蛋白，编码膜蛋白编码核衣充蛋白蛋白是的主要结构蛋白之一，为非糖基化的结构蛋白，娃动脉炎病每最保守的蛋白’〗，在病毒的装配和出芽过程中发挥着重要作用在病毒粒子中蛋和蛋白以异源二聚体的形式存在，是动脉炎病毒的感染性所必须的并且的蛋白还有助于稳定受体结合的病毒吸附位点而且蛋白的存在有助于诱导细胞免疫反应和产生中和抗体】。年，丨和创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体【。近年来，单克隆抗体应用于病毒蛋白的结构和功能的研究越来越广泛，成为病每学研究领域不可缺少的具。国内外学者利用全病毒或重组蛋白，已经成功制备出、、、、以及的单克隆抗体，为鉴定这些蛋白的表位和研究蛋功能奠定了基础里然己经证实蛋内是的免疫优势蛋白丨具有很强的免疫原性，并且己经制备出针对蛋内的单克隆抗体及鉴定了抗原表位，，但是到目前为止，以蛋白为基础建立的的检测方法以及利用蛋白单克隆抗体分析其生物学功能的研究鲜有报道。本章我们利用超速离心纯化的免疫小鼠，以期制备出针对蛋的单克隆抗体，为检测与诊断技术以及相关研究提供物质基础。 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与墟定材料与方法实验材料病毒、细胞、质粒和血清高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株丨细胞、细胞和细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物病原监测与流行病学创新团队（以下称“本实验室”保存，分别用含有〗和的培养液于°、培养箱中培养，分别用于的培养、瞬时转染和单克隆抗体的制备；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和其他疫苗株、、和由本实验室保存；真核表达质粒和由本实验室构建并保存；猪高免血清【及阴性血清由本实验室制备。实验动物周龄和周龄小鼠，购中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。主要试剂、耗材及试剂盒单克隆抗体由本实验室制备并保存；蛋白浓度测定试剂盒、和上样缓冲液购自碧云天生物技术研究所；标记的山羊抗小鼠和标记的山羊抗小鼠购自北京中杉金桥生物技术有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、、、、甘油、、过硫酸铵和购公司；、甘氨酸、、和考马斯亮蓝购自公司；秋水仙素和姬姆氏色素购自国药集团化学试剂有限公司；树脂及层析柱购自金斯瑞生物科技有限公司；购自哈尔滨宝泰克生物科技有限公司；购自公司；购自公司；膜购公司；脱脂乳购自公司；单抗购自公司；购自公司；购自公司；和显色液购白公司；酶标板购自公司。细胞培养试剂培养液：购自公司，°保存备用。胎牛血清（购自公司，。保存备用。生长培养液：于溶液中加入的，°保存备用。维持培养液：于溶液中加入的。保存备用。青链霉素溶液（双抗：取青链霉素各溶于灭菌去离子水中，过滤除菌，分装，。保存备用。 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定：加加热完全溶解后，定容至丨，室温保存。胰溶液：胰酶溶于中，调至，过滤除菌，分装，°保存备用。生长培养液：于溶液中加入的，按照。的比例加入双抗，°保存备用。储存液：将一瓶粉末用稀释。保存备选择培养液：于生长培养液中加入的储存液，°保存备用。选择培养液：于生长培养液中加入的储存液，°保存备叫。细胞冻存液：加，现用现配。染液：粉甘油将粉置丁■研钵内先用少量甘油与之充分泥合，研磨至无颗粒至少研磨以上；然后将剩余的甘油泥在一起，°保温后，加入纯甲醇，保存于棕色瓶内，°保存周。临时将备液与按照混合。细胞裂解液：先配成称取然后用调至先配成称取然后用调至先配成称取先配成称取分别加入、、、甘油、，再加入充分溶解后定界至，使其各成分终浓度分别为、、、的甘油、丨％的°保存备用。临前加终浓度为的和的。蛋白质电泳相关溶液丙稀敢胺：购康润生物）公司，°保存备用。过硫酸铵：将过硫酸铵溶解于中，分装后丁°：保存备用。将溶解丁中，用浓调值至再用将溶液定容至置°保存备用。将溶解于中，用浓调值至再用将溶液定弃至置°保存备。；将溶于中，室温保存。电泳缓冲液：称取、甘氣酸、加入约搅拌溶解，加定容至宰温保存。考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝置于烧杯中；量取的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入的冰醋酸，搜拌混勾；加入的去离子水，搅拌混勾；滤纸除去颗粒物质后，鬼温保存。 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定相关溶液蛋白转印缓冲液：称取甘氨酸、、加的充分搅拌溶解，加入的甲醇，定容至室温保存。封闭液：脱脂乳，用配，现用现配。；溶液中加入叫，混勾，室温保存。一抗稀释液：购自碧云天生物技术研究所。单抗纯化相关溶液。：丨甘氨酸，。：。相关溶液碳酸盐包被液（，：加溶解，调°保存备用。：溶液中加入混匀，室温保存。封闭液：脱脂乳，用配，现用现配。终止液（：浓硫酸加至室温保存。主要仪器设备系列二氧化碳培养箱，购自美国公司；超速离心机，购自美国公司；高通量组织研磨仪，购自德国公司；高速冷冻离心机，购自德国公司；小型台式高速离心机，购自德国公司；超低温冰箱，购自海尔公司；型三孔电热恒温水槽，购自上海一恒科技有限公司；倒置焚光显微镜，购自日本公司；基础电泳仪和高电流电泳仪，购自美国公司；半干转印槽，购自美国公司；近红外焚光扫描成像系统，购自美国公司’酶标仪，购自瑞士公司。实验方法免疫原的制备病毒的接种与收获：将细胞用胰酶消化成单个细胞后，以约个的密度接种于个细胞培养瓶，并补加培养液至置于°、 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定细胞培养箱中培养过夜，形成的细胞单层，弃上清，用稀释至接种于细胞培养瓶中，放入°、细胞培养箱中辉育弃上清并加入培养液继续培养，大约细胞病变（达到时收获病毒，反复冻融次，离心取上清。保存。病毒的纯化：离心后的病毒上清用转子，离心沉淀用悬起，经测定蛋白浓度后°保存。小鼠免疫将病毒用稀释后与等体积的弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，只，以后每间隔周将稀释的病毒与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫，免疫次，末次免疫周后直接将病毒注射于腹腔加强免疫，第取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。细胞融合及杂交瘤细胞的蹄选词养层细胞的制备：在融合前一天，将健康小鼠眼球釆血，分离血清作为阴性血清，并断颈处死，酒精浸泡，体表消毒移入超净工作台内，岡定于解剖板上，用灭菌服科剪刀、摄子剪开股部皮肤（不可损伤腹膜），经钝性剥离使腹膜充分暴露。酒精棉擦拭消毒，用注射器配上注射器针头于小鼠腹腔注入选择培养液，用摄子夹取酒精棉轻轻按摩小鼠腹部，使刺激更充分，巨膝细胞释放更完全，再注射器抽出腹腔内的培养液，加入到准备好的培养液中，调整细胞浓度为个—般一只小鼠的词养细胞铺块培养板准备做融合，将细胞悬液混勾后加入到孔细胞培养板中，每孔，镜下观察词养层密度，置于°、培养箱中培养。后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁：效果良好，无污染即可使用。骨髓瘤细胞的准备：融合前两周从液氣中取出冻存的骨髓瘤细胞进行复苏，用生长培养液培养，丁融合前扩大培养，镜下观察，细胞生长状态良好时可用于细胞融合。将处丁生长旺盛期的细胞收集至离心管中，离心，弃去上清，用培养液洗潘一次后，重悬细胞、计数，用于融合。脾细胞的制备：取加强免疫后的小鼠，摘去眼球釆血，分离血清作为蹄选阳性克隆细胞孔的阳性对照。将小鼠断颈处死，酒精浸泡，体表消毒移入超净工作台内，固定丁解剖板上。用灭过菌的慑子和剪刀剪开小鼠外层皮肤、腹膜，无菌取出脾脏，尽量不要剪卜周围的结缔组织。放入无菌培养皿中，用培养液冲洗脾脏表面，然后小心剥离附着在脾脏表面的结缔组织和脂肪，将脾脏移入另一无菌培养皿中，加入培养液，先用注射器针头在脾的一侧扎数个孔，另一侧用镊子夹起，】注射器配上的针头缓慢注入培养液，反复吹打，直到脾无血色。收集培养液并转移至离心管中，离心重悬细胞、计数，用于融合。细胞融合：将制备好的免疫脾细胞和骨髓瘤细胞悬液，按的比例混合于离心管中，充分捉句。丨离心丨，弃上清。轻弹离心管底，使细胞沉淀充分混勻成糊状，将离心管置于预热的°水浴的烧杯中。吸取°预热的在轻轻摇动离心管的同时缓慢滴入细胞中，内加完，静置，】内加入°预热 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定的内加入预热的，内加入预热的内加入预热的边滴边转动离心管，离心弃上清，加入培养液，再洗一次，除去残留。将沉淀细胞轻悬于选择培养液中，混勾，将细胞悬液加入到有饲养细胞的孔细胞培养板中，每孔置°培养箱中培养。阳性杂交瘤细胞的蹄选及克隆：将细胞以个的密度接种于个细胞培养瓶培养过夜，待形成的细胞单层时，一瓶细胞接种〗另一瓶作为对照，待病变达到时，弃去培养液，用胰酶消化细胞，用将病变的细胞和正常的细胞混在一起，离心用适量重悬细胞，将细胞涂于孔载玻片上，镜下观察调整细胞密度，自然晾干，用°预冷的丙酮室温固定，瞭干，°储存备用。融合后的细胞注意观察，待孔板中细胞生长至孔底面积丨时，约〗，取出细胞培养上清滴加至载玻片孔内，同时上淸作阴性对照，并设阳、阴性鼠血清对照°孵育用洗次，每次充分腺干，滴加倍稀释的标记的山羊抗小鼠，孵育用洗次，每次，腺干，每个孔滴加一滴的甘油（用配，将盖玻片盖上，炎光显微镜下观察，只有部分细胞发绿色突光的孔判定为阳性。将检测为阳性孔中的杂交瘤细胞集落悬起混匀，取出少量准确计数后，根据计数结果吸取一定量至无菌小瓶中进行系列稀释，稀释至含个细胞，将稀释好的细胞悬液以每孔加入到含有饲养细胞的％孔细胞培养板中培养，左右进行蹄选阳性细胞孔。次亚克隆后，直至所有克隆化细胞孔阳性率为时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其扩大培养收集上清即为单抗上清。细胞培养液从融合时逐渐过渡，由更换为最终更换为含的培养液。真核细胞转染：转染前一天接种细胞至孔板，每孔细胞数个，转染时的最佳密度为然后按照说明书进行操作：将、质粒（和与稀释液（平衡至°短暂漩祸混勾；用稀释液将质粒稀释至终浓度为质粒培养基，轻柔混勾；将直接添加至含稀释质粒的培养基中切勿接触到塑料管壁，轻柔混合；。：下孵育转染试剂质粒复合物；从培养箱中取出细胞培养板，无需弃去生长培养基，将转染复合物逐滴加至细胞中继续培养收获细胞，涂在载玻片上（同上）》筛选蛋白单克隆抗体：将筛选的的单克隆抗体上清加至含表达的细胞的孔内，其余步骤同上，突光显微镜下观察有绿色焚光的孔对应的单抗即为蛋白单克隆抗体。单抗与其它毒株的反应性：将、、、和接种细胞，进行同上），分析单克隆抗体与其它的反应性。杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冻存：将生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞吹打均勾，分装于离心管中，离心收集细胞，用细胞冻存液将细胞稀释至个加入到细胞冻存管中，做 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定好标记，将冻存管放入装满异丙醇的细胞冻存盒中至°冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，做好记录。细胞复苏：自液氣容器中取出冻存管，迅速放入°水浴中，摇动使其快速融化后，移至超净工作台，打开冻存管，将冻存管内细胞悬液加入到含有适量的离心管中，离心洗漆细胞，弃上清，用含的培养液重悬细胞，移入细胞培养瓶中，补加细胞培养液，°培养。杂交瘤细胞的染色体鉴定采用秋水仙素法，将生长状态良好的杂交瘤细胞传代，后加入秋水仙素，使其终浓度为继续培养。吹下培养瓶中的细胞，离心弃上清；加°预热的低渗液，重悬细胞，置下低滲处理丨；加入新鲜配制的固定液（甲醇与冰醋酸泡合）边滴加边混匀，离心弃上清；再加入固定液将细胞沉淀重悬并混勾，静置后，离心弃上清；重复操作一次，然后加入固定液，将细胞沉淀悬浮并混勾，室温放置，离心小心吸去上清，保留少许固定液与细胞混勾后滴丨滴悬液至冰上预冷载玻片上；干燥后，染色；镜下选抒染色体形态完整、分散良好、无重叠、无失散的细胞进行观察并拍照。：单克隆抗体特性的鉴定亚类的鉴定：按照免疫球蛋白亚类分析试剂盒说明书进行操作，平衡底物和板条至室温；加单抗上清至每个板条（每孔已包被鼠§，，轻链，轻链的抗体）的个孔内，再加羊抗鼠丨结合物轻轻泡习，室温孵育，弃上清，每孔加洗板次，每次加底物，室温孵育加，读数，值大于视为阳性。分析：将细胞用胰酶消化成单个细胞后，以约个的密度接种于孔板，待形成的细胞单层时，每孔接种个丁：丨。（步骤同上），同时设对照孔，时，收获细胞，步骤如下：弃上清，用预冷的洗遍细胞，每孔加细胞裂解液冰上裂解收集细胞，°离心取上清测蛋白浓度，吸取统一的蛋白总量并用细胞裂解液补齐，按的比例加入上样缓冲液沸水煮离心进行及分析，步骤如下：制胶：按比例配置的分离胶和的浓缩胶，待胶完全聚合后，安装到电泳槽中，小心拔去梳子，加入丨电泳缓冲液；加样：分别取适量的蛋和待检的样品加入到胶的加样孔内，调适当的电压进行屯泳，一般浓缩胶用，待样品跑到浓缩胶与分离胶的交界时，将电压调为继续电泳，直到溴酷蓝到达胶的底部时即可停止电泳；转印：按胶的大小剪好膜和滤纸，放入转膜液中，将膜、胶和滤纸在转膜液中浸泡，按照滤纸、膜、胶和滤纸的顺序依次从下向上放好，使膜位于正极，胶位于负极，赶走气泡，在的电压下转印 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定免疫反应：转膜完成后，取出膜放入脱脂乳中室温封闭或°过夜，弃去封闭液，洗膜次，每次，将膜放入相应的单抗上清中室温鮮育，洗膜次，再将膜放入倍稀释的抗鼠红外焚光二抗（中室温孵育，洗膜次；显色：将膜放入近红外荧光扫描成像系统中，扫描成像。效价的测定：将两株单克隆抗体上清和用倍倍比稀释做同上），以能看见绿色劳光的最大抗体稀释度作为此单抗的效价。阻断将超速离心的用包被液稀释，孔，每孔，加入至酶标板中，°包被过夜，弃去板中液体，用洗漆次；加封闭液孔，°封闭弃去板中液体，用洗涤次；加入从开始倍倍比稀释的阴阳性血清，每孔丨°作用弃去板中液体，丁洗潘次；加入单抗上清，每孔°作用弃去板中液体，用洗潘次；加入丨稀释的标记的山羊抗小鼠，每孔°作用弃去板中液体，用洗漆次；加入显色液室温显色孔终止反应，用酶标仪测定每孔的值。单克隆抗体的大量制备和纯化腹水的制备：取周龄的小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂只；后腔接种稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠个间隔后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用注射器配带注射器针头采集腹水，一般可采次，通常每只小鼠可采腹水。亲和层析纯化单抗：按说明书进行，将腹水于冰上解冻，°离心弃去上层油脂及管底沉淀；混匀的树脂，吸至预先加了的层析柱中，打开底部旋钮让树脂自然下沉使液体流出；加平衡树脂，然后使液体流出；用按至少的比例稀释腹水，加入平衡好的柱子中，晃动数分钟使其充分结合，然后打幵旋钮收集流出液用于检测树脂的结合效率；加洗漆树脂，加次，每次留少许洗漆液；用洗脱蛋白，收集洗脱液，立即加入〗体积的中和洗脱液至将洗脱液加入透析袋中用大于倍体积°透析过夜，浓缩抗体，测蛋白浓度，分装°保存。将纯化好的单抗进行及分析。结果与分析病毒的纯化及鉴定培养的经超速离心后，测定蛋白浓度为。分析结果显示，天然病毒裂解后，里现多条病毒结构蛋白的条带（图，分析结果显示，超速离心的能够被特异性的单克隆抗体所结合（图 中国农业人学博丨：学位论文第二章沾繁殖呼吸综合征侦毒进单克降抗体的制备勾膝定。“丨丨“‘彳妨⋯掩參海「一：丨：图超速离心的的及分析：质分了质标准；超速离‘心的细胞融合及杂交瘤细胞株的蹄选取免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经选抒性培养基蹄选，第开始山现融合细胞，待细胞团约为孔内】时，利进行蹄选，卩丨性孔令交瘤细胞株经次亚克隆，最后叫含转染质粒的细胞进行丨检测，最终获得株分泌抗蛋内单克隆抗体的交瘤细胞株，分别命名为和。结果显示，单抗能够识别基别及疫苗株丨、、而不能识别基闪嘲和株（图单抗能够识别基因別疫苗株、和基网型而不能识别基闪型株（图。杂交瘤细胞的染色体鉴定经秋水仙素法检测，细胞的平均染色体数为，小鼠脾细胞的染色体数为，而彡々交瘤细胞的平均染色体数为。结果证实，获得的彡；交瘤细胞为融合所得（阁。 屮农业大学博士学位论文第二卓猪繁殖与呼吸综合征病海蛋白中克隆抗体的制格与鉴定■■■■■■■■■■■■■■■图蛋白单克隆抗体和与、疫苗株和表达蛋白的细胞的反应（、、图株杂交瘤细胞的染色体鉴定（ 中农业人学搏丨：学位论义第：章沾繁附。呼吸泣介征病毒出中克降抗体的制谷；猫定单克隆抗体特性的鉴定亚类的鉴定川抗体亚类试剂盒对单克隆抗体的类和轻链耶进行了鉴定。结果显示，为亚类，为亚类，轻链均为链表丨）。表单克隆抗体的类型鉴定分析单克隆抗体的特异性接种细胞，并设细胞对照，时收获细胞，细胞裂解液裂解细胞后，测细胞总蛋白浓度，将相同的蛋内进行及分别单抗、单抗和制备的株蛋内单克隆抗体进行检测。结果显示，和单克隆抗体均能特异性地识别的蛋白（图。、釋二，禪图分析抗蛋白单克隆抗体的特异性两株单抗的效价测定将株彡』交瘤细胞培养上清，作倍倍比稀释，加入孔载玻片孔内的病毒感染的细胞上做，最后叫炎光显微镜观察。结果显示，单克隆抗体上清的效价为图。阻断符先包被超速离心的病毒，封，然后加倍倍比稀释的阴、卩性血请，再加单克隆抗体（朱交瘤细胞坑养上消），进丨阻断分折单克隆抗体的特异性。从閣可以山，阴性血清的外没随着稀释仿数的提高而有明显变化相反件血沾稀样倍数越人，也就相丨、的特异性抗沐越少值越，说明越来越多的单克隆抗体。病毋抗原结合，就说明卩丨丨性血洁能够肌断隆抗体」；抗原的结，即和病的结能被彳丨性血淸阻断。 屮农业大学博十学位论文第二阜猪繁娇与呼吸综合征病蛋白中克降抗体的制洛与鉴走■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■图单克陰抗体效价的测定（：单克降抗体；单克隆抗体）。“““■■“■。‘。‘、”“—一‘■“■‘：：：图阳性血清阻断蛋白单克隆抗体与病毒的结合 中农业人学博丨：学位论文第—章沾繁柄呼吸综合征病毒饭降抗体的制」格定单克隆抗体的纯化余和层析技术将株交瘤细胞株制备的股水进行纯化，采川分析纯化效果。结求表明，己经获得高度纯化的单克隆抗体纯化的单抗的轻重链可能存在修饰导致链两条带、轻链偏人（图。结见显示，接丨』抗城的红外炎光—抗检测能显示山特异的条带（圍。崎——图单克隆抗体的纯化（及丨分析（：进白质分了质标准；纯化的纯化的讨论现在关丁单克隆抗体制备报道很多，但人多数都是原核表达的蛋免疫小鼠然后在其作为检测抗原蹄选交瘤细胞株，这样的方法问题在丁所用的抗原必须纯化，而且重组蛋白并不能代表真实的大然病毒的结构。本研究为了避免这样的问题，我们宵先将人足收集的细胞上清超速离心，然后免疫小鼠，蹄选杂交瘤细胞时叫病毒感染的细胞和未感染的细胞混合作为检测抗原，视野中只有部分细胞染成绿色的才判定为阳性，从而避免了假卩丨丨性问题，这样制备的单抗能特异性地识别，再丨表达蛋内的真核质粒转染细胞进而蹄选勾蛋內反应的单克隆抗体。阻断结果表明，制备的两株蛋白单克隆抗体能够被卩丨性血清所阻断，几有沿在的应用价值。并且利制备的单克隆抗体可对蛋白进行抗原表位的鉴定，能够丰富蛋内的抗原结构。前研究病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的土要方法是免疫共沉淀（即某个病毒蛋内的真核表达质粒与某个宿主蛋白真核质粒共转染，然后标签抗体成病毒蛋内抗体进行免疫沉淀来蹄选成验证蛋白之间的相作该方法迅然简单明了，可彳了性强，但也存￡一定的缺陪。宵先，转染到细胞内的病毒蛋内并不娃病毋的大然构象，蹄选的棺卞蛋病岛感染状态卜的所差异；其次，通过单独丧达某个病毒蛋内来筛选成鉴定：相力：作叫的估■；细胞造时，某些需耍其他病进辅助成者通过其他病岛蛋接相力：作⑴的估：细胞进内就会被遗制掉第二，某些病的宿土细胞转染效率很低，导致转染实验无法在衍」细胞上成，只能僻助染效率高的细胞系如细胞，作为投式细胞来进汀々染实验，模式细胞能在物种、功能，方面与宿主细胞存在很人的左异，闪此也有可能导致实验结见川现定的 中国农业大学博士学位论文第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白单克隆抗体的制备与鉴定偏差。鉴于以上原因，本研究首先制备蛋白单克隆抗体并将其纯化，然后用感染细胞，利用蛋白特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀并结合质谱分析蹄选与蛋白相互作用的宿主蛋白，该方法可以很好地弥补以上的不足。具有严格的宿主细胞嗜性，仅有几种细胞适合的感染与复制，包括猪肺泡巨唆细胞（、非洲绿猴的肾脏细胞系（及其衍生细胞系（丨、而高致病性疫苗株是高致病性在细胞上传代次获得的】，它在猪原代内几乎不复制（本实验室文章未发表），因此我们选择用感染细胞进行与病毒蛋白互作的宿主细胞蛋白的蹄选实验。小结利用纯化的采用杂交瘤技术成功制备山了株高效价的蛋白单克隆抗体和，亚类分别为和。对单克隆抗体的特异性进行了鉴定，株单克隆抗体均可识别，与的结合反应能够被阳性血清所阻断，提示制备的单克隆抗体可用于阻断方法的建立。 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定摘要：利用制备的株蛋白单克隆抗体，对蛋白进行了抗原表位的鉴定。首先将蛋白截短表达段，进行分析。结果显示，单克隆抗体识别单克隆抗体识别：进一步对这两段分别截短为段，最后经寡核苷酸直接退火连接到表达载体进行表达，结果显示识别的，单抗识别的研究结果表明，单克隆抗体和识别的表位为首次确认的蛋白线性表位。氧基酸序列比较显示，鉴定的个表位在基因型毒株中高度保守，而在基因型毒株中存在缺失和突变。该研究为蛋白的抗原结构提供了科学依据。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，蛋白，单克隆抗体，抗原表位引言猪繁殖与呼吸综合征病毒归类于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毋属成员，同属成员还有马动脉炎病毒（、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒（和猴出血热病毒（。根据病毒的抗原性和基因组的差异，分为以欧洲型毒株为代表的基因型和以北美型为代表的基因型（。的蛋白是一个基因型）或基因型）的型跨膜蛋白，由一个次连续的跨膜区、个氨基酸的胞外区和个氨基酸的胞内区构成它只存个氨基酸残基暴露于病毒粒子表面利用唆菌体展示技术和感染后期的猪血清，鉴定出了基因型蛋白胞内区的抗原表位位于。之后利用肽扫描技术和份北美型感染的猪血清，鉴定出蛋白的抗原表位，位于端胞内区的丨和因此两段重叠的区域被认为是最小的抗体结合位点】。蛋白与蛋白在病毒粒子上形成二硫键相连的异源二聚体对于动脉炎病毒的感染是必须的，】。这些异源二聚体位于感染细胞的内质网上或病毒装配过程中，，，。在基因型毒株中，和的二硫键结合分别发生在位氨基酸残基和位氨基酸残基，突变任何一个氨基酸都会完全阻断病毒粒子的产生，表明和的共价键结合对于病毒的装配是必须的丨】。在，和蛋白对于病毒粒子形成也是不可或缺的丨在此结构有助丁稳定与受体结合的病毒吸附位点。有研究表明，冠状病毒的蛋白有助于病毒的装配和山芽，进而推测动脉炎病毒的蛋白也具有类的功能】。本章将利用上一章制备的株蛋白单克隆抗体，对其识别的蛋内细胞线性表位进行鉴定，以期为更精细地了解蛋白的抗原结构以及功能的基础研究和实际应提供科学依据。 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定材料与方法实验材料载体与菌株的全长感染性克隆质粒、、感受态细胞及由本实验室保存；载体购自公司。主要试剂、耗材及试剂盒、、、、和购自公司；购北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自公司；购自公司；氨节青霉素（和琼脂粉购自公司；和购公司；上样缓冲液购碧云天生物技术研究所购公司；膜购自公司；脱脂乳购自公司；购自公司。分子克隆所用溶液核酸染料：购自北京金博益生物技术有限公司。电泳缓冲液：称取、，然后加入的充分搅拌溶解，加入的醋酸，充分混匀，加定奔至室温保存，二作液为。琼脂糖凝胶：称取琼脂糖加入的电泳缓冲液，加热融化，待温度降至°时加入的核酸染料，倒入胶板中，完全凝固后即可使用。氣节青奪素（储存液：取氨节青霉素溶解于中，使其浓度为过滤除菌，分装，°保存备用。液体培养基：称取、、加入中，用调至，定容至，°高压灭菌室温保存备用。液体培养基：在液体培养基中，按终浓度加入储存液，°保存备用。固体培养基琼脂粉溶于液体培养基中，°高压灭菌冷却至°左右，加入储存液至终浓度为混勻倒平板，°保存备用》蛋白质电泳相关溶液丙稀醜胺：购自康润生物）公司，°保存备用。过硫酸铵：将过硫酸按溶解于中，分装后于°保存备用。：将溶解于中，用浓调值至再用将溶液定容至，置°保存备用。 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定将溶解于中，用浓丨调值至，再用将溶液定容至置°保存备用。：将溶于中，室温保存。电泳缓冲液：称取、甘氧酸、加入约搅拌溶解，加定容至，室温保存。相关溶液蛋白转印缓冲液：称取甘氨酸、、加的，充分搅拌溶解，加入的甲醇，定界至室温保存。封闭液：脱脂乳，用配，现现配。：溶液中加入泥勾，室温保存。主要仪器设备仪，购自德国公司；核酸电泳仪，购自北京百晶生物技术有限公司；小型台式高速离心机，购德国公司；型三孔电热恒温水槽，购上海一恒科技有限公司；型低温连接仪，购自珠海黑马医学仪器有限公司；恒温培养摇床，购自上海福玛实验设备有限公司；超净工作台，购自公司；分光光度计，购自公司；凝胶成像系统，购￡美国公司；基础电泳仪相高电流电泳仪，购美国公司；半干转印槽，购自美国公司；近红外焚光扫描成像系统，购自美国公司。用于本研究的毒株表本文引用的 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定实验方法引物设计根据本实验室获得的疫苗株的全基因组核甘酸序列，运用软件设计的扩增引物及其截短表达引物，由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。表的扩増引物及其截短表达引物 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的盤定 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定】注：代表正向引物，代表反向引物；酶切位点用斜体表示；终止密码子用加粗表示。按下列组成配置反应液，建立反应体系： 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定上游引物（下游引物（性质粒反应条件：。°°。。。重复个循环产物的胶回收产物经的琼脂糖电泳分离后，将符合预期大小的目的条带切下，使用的胶回收试剂盒进行回收，步骤如下：将切下的的条带放入离心管中称重，加入等体积的在°的水浴中，间断晃动离心管，直到条带完全溶解；将吸附柱）放入收集管中，然后加入琼脂糖溶液至吸附柱里，离心弃去液体，重新将吸附柱放入收集管中，加入离心弃去液体，重新将吸附柱放入收集管中，加入预先加了无水乙醇），离心重复上述一次，弃去液体，重新将吸附柱放入收集管中；将吸附柱以最大转速（大于离心使吸附膜干燥；将吸附柱放入一个干净的的离心管中，加入至吸附膜上，室温静置然后以最大转速离心收集洗脱液，分光光度计测定浓度，°保存。克隆载体的构建回收产物（命名与载体的连接：回收产物（轻轻混勾，°连接过夜。连接产物的转化：从°：冰箱中取出感受态菌液在冰上使之慢慢融化，加入连接产物冰浴之后将离心管置°水浴中热激后，立即冰浴加入丨无抗生素液体培养基，°摇床（培养将培养物 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定离心弃去大部分上清，取菌液均匀涂布于含有的固体培养基上，°培养挑菌：挑取单个菌落于含有千分之一的液体培养基中，°摇床（培养左右。重组菌液的鉴定及测序：将上下游引物（各菌液和加至管内混匀，进行扩增，条件同上，取产物进行电泳，将阳性的菌液送测序公司进行测序，每个片段挑取个进行测序。原核表达载体的构建重组质粒的提取：使用的质粒小量提取试剂盒进行操作，步骤如下：将过夜培养的的阳性菌液置于（多个）离心管中，离心弃去上清，再瞬离数秒，使管壁的液体完全离到管底，用移液器吸挣；加的重悬菌体沉淀，（混至一管）；加的温和地颠倒次使菌液澄清，短暂的室温静置是必要的；加的温和地颠倒次使菌液形成白色沉淀，离心将上清转移至放入收集管中的吸附柱）中，离心弃去底部的液体；加的洗漆吸附柱，离心，弃去底部的液体；加的预先加了无水乙醇）洗涤吸附柱，离心弃去底部的液体；重复上述步骤一次；空离丨，使吸附柱干燥；加入的静置，离心，收集洗脱液，分光光度计测定浓度，°保存。重组质粒（和载体（和的双酶切（体系）及回收：重组质粒°水浴，琼脂糖凝胶电泳，将符合预期大小的的条带切下，使用的胶回收试剂盒进行回收，步骤同上。回收产物与表达载体的连接：目的片段载体轻轻混勾，°连接过夜。连接产物的转化、挑菌、单双酶切及鉴定：转化挑菌步骤同上，单酶切反应体系（ 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定重组质粒細双酶切反应体系（重组质粒°水浴，琼脂糖凝胶电泳分析结果。鉴定：将上下游引物（丨各，质粒和加至管内混匀，进行扩增，条件同上，取产物用琼脂糖凝胶屯泳分析结果。寡聚核酸片段的退火：将上下游引物（丨各泥合于管内，放入仪中，°变性，关闭仪，让其然降至室温，退火合成双链分子片段与和双酶切回收的带有點性末端的和进行连接转化，直接挑菌进行送测序。诱导表达将重组质粒转化到感受态中，挑取单个菌落接种于液体培养基中，°培养过夜（在中就可直接诱导表达）；以的比例分别将含有重组质粒和空载体的菌液接种于含有的液体培养基中，°培养；待菌液浓度达到时，加入终浓度至，继续诱导培养将培养物离心后倍体积的重悬，加等体积的上样缓冲液沸水煮离心，取上清进行及分析。和分析制胶：按比例配置的分离胶和的浓缩胶，待胶完全聚合后，安装到电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液；加样：分别取适量的蛋白和待检的样品加入到胶的加样孔内，调适当的电压进行电泳，一般浓缩胶用，待样品跑到浓缩胶与分离胶的交界时，将电压调为继续电泳，直到溴酷蓝到达胶的底部时即可停止电泳；转印：按胶的大小剪好膜和滤纸，放入转膜液中浸泡按照滤纸、膜、胶和滤纸的顺序依次从下向上放好，使膜位于正极，胶位于负极，赶走气泡，在的电压下转印；免疫反应：转膜完成后，取出膜放入脱脂乳中室温封闭或°过夜，弃去封闭液，洗膜次，每次，将膜放入相应的单克隆抗体上清中室温孵育洗 中国农业人学博丨：学位论文第三章站繁稍与呼吸综合征病毒细胞线性表位的鉴定膜次，再将膜放入倍稀释的红外劳光二抗中室温經育，洗膜次；显色：将膜放入近红外焚光扫描成像系统中，扫描成像。蛋白的氨基酸序列比对分析为了分析和单克隆抗体所识别的表位在不同不同毒株中的差异，参照收录的代表逛株（表的序列，运用生物学软件进行氨基酸序列比对。结果与分析及其截短片段的扩增根据设计的对扩增引物，采用方法，分别扩增山及其截短基闪片段，经的琼脂糖凝胶屯泳，丁紫外线下观察到条与预期片段度一致的条带（图。图及其截短片段的扩增各基因片段原核表达载体的单、双酶切及鉴定将上述、和产物问收后勾载体选接，测序正确后，与原核表达载体分别叫和双酶切并用连接酶连接，得到原核表达载体，提取质粒并做单双醜切及鉴定确定载体构建止确（图’同样，将上述、和产物冋收后与载体连接，测序止确后，与原核表达载体分别用和双酶切并叫迎接酶述接，得到原核表达载体，提取质粒并做单双酶切及鉴定确定载体构建￡确（图。 中牧业人学博丨：学位论文第三章济繁殖呼吸综合征病毒进细胞线性表位的鉴定食’从‘，‘‘■‘■；」、次、、、、、、、、矣分■—“图重组表达载体的酶切及鉴定。、、、、、、於、、、，、分、於次、次‘々‘求、次■。、命。。、广、。⑶知一图重组表达载体的酶切及鉴定 中农业大学博丨：学位论文第三章站繁殖与呼吸综合征病禅细胞线性表位的鉴定单克隆抗体和识别蛋白表位的鉴定将构建好的转化到感受态中进行诱导表达（在中就可直接诱导表达），菌体处理后转印至膜上进行分析，结果发现和单克隆抗体均识别重组的蛋内；将蛋白进一步截短为，结來显示识别，识别将继续截短为结果识别将截短为和识别，然后将合成的寡聚核酸片段直接进行退火，构建一系列的以为骨架两端逐个缺火氨基酸的原核表达载体，进行如上的分析，根据结來推断山识别蛋内的单独构建此短肽验证了此结果（图而蹄选识别的表位也娃通过逐步截短，然后两端逐个缺火氨基酸确定的，最后表明此单克隆抗体识别蛋内的。表少》人、，人，輪塵餐筹細分分分；分少少、、十、—人‘‘：‘—■、★勒、琴卿參》》、、入入、么、，’、、’：夕务、一翁、？麟图蛋白及其截短片段的抗原性鉴定识别的蛋抗原表位分析；（识别的击抗原表位分析 中农业大学博丨学位论文第三章猪繁始。呼吸综合征病毋细胞线件表位的览定不同毒株蛋白的氨基酸序列对比分析以上分析表明，单克隆抗体识别的蛋表位为识别的蛋内表位为。将鉴定的个蛋内抗原表位与已发表的不同株的蛋白氨基酸序列进行比对，发现这个表位在高致病性和经典毒株之间高度保守，蛋内的表位在基闪株缺火个氨基酸，也就娃说基网报毒株不存在这个农位，而蛋的表位在基闪？毒株有个氣甚俊的突变（图。■图单克隆抗体丨和识别抗原表位的氨基酸序列比对；；：由株相丨的氣难酸以表小，缺失的筑妹梭以表讨论前，抗原表位作图的方法有很多，如研究抗原抗体复合物的晶体结构、氨基酸定点突变技术和哩歯体展示技术竞争分析法、肽扫描技术和基闪表达分析法是应最为广泛以及技术最成熟的方法。竞争分析法进行表位作图娃应非常丨’泛的一种方法，该法能够快速鉴定两种不同的单克隆抗体是否能够与同一蛋质抗原结合，或他们与蛋内质结合位点娃否重登。如束两种抗体结合同一位点，两者就不可能同时与一特定抗原结合。随着单兑隆抗体技术在竞争分析法中的应使得一系列蛋内质抗原的空间结构表位得以确定，该方法常通而且十分准确。例如，川这种方法已经确定了多种人抗原上独立的表位。这种方法特别适鉴定针对特殊蛋内的新的单克隆抗体勾识别同样抗原的其他单克隆抗体的差异。此法既可与构象表位结合的抗体，也可丨〗」线性表位结合的抗体分析。 中国农业大学博士学位论文第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白细胞线性表位的鉴定肽扫描技术（是利用合成肽对蛋白质进行表位作图的方法，即合成某种抗原蛋白许多重叠的短肽，分析它们与相应抗体的结合状态，以确定在抗原蛋白分子上表位的具体位置，这种方法可以且只可以用来鉴定线性抗原表位。严玉霖利用技术对区细胞抗原表位进行了分析，结果鉴定出存在于高变区中的个细胞线性表位。郭龙军丨首先将蛋白截短表达，然后利用合成多肽对抗原表位做精确扫描定位，结果显示表位核心序列为。然而大多数抗原表位是由氣基酸序列上彼此不相连而在空间结构上彼此靠近的构象表位，因此肽扫描不能提供完整的抗原表位信息。本实验所釆取的是基因片段重叠表达技术对蛋白进行抗原表位作图，本方法是将蛋白质基因分段成数个重叠的基因片段，利用重组技术，克隆、表达这些基因片段，利用免疫印迹对表达的多肽进行鉴定，从而蹄选出具有抗原性的基因片段。由于截短到后期，氨基酸数太少，不易获得，短肽人合成又很昂贵，所以本实验采退火寡聚核酸合成法，相对简单，周期短，且成本较低，可行性高。首先合成互补的具有粘性末端的寡核酸片段，直接退火成双链分子，直接与表达载体相连接，转化大肠杆菌，进行诱导表达，从而获得所需要的短肽融合蛋白通过此方法合成获得的短肽融合蛋白成本低、表达量高且反应性好，可以为抗原表位的定位提供基础。賺【通过技术鉴定出了蛋白的抗原表位（，‘噬菌体展示技术鉴定出了基因型蛋白胞内区的抗原表位位于而本研究精确鉴定出的抗原表位和为新发现的存在于基因型的细胞线性表位，丰富了蛋白的抗原表位，为进一步了解蛋白抗原结构提供了理论依据。小结采用方法鉴定出单克隆抗体识别的蛋白细胞线性表位位于。采用方法鉴定出单克隆抗体识别的蛋白细胞线性表位位于氨基酸序列比对显示，鉴定出的个蛋白细胞线性表位在基因型毒株中高度保守，而在基因型毒株中存在缺失和突变。 中国农业大学溥士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与分析第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析摘要：利用蛋白单克隆抗体，采用免疫共沉淀（结合串联质谱（方法，蹄迭与蛋白相互作用的宿主细跑蛋白，并对蹄选出的细胞蛋白进行生物信息学分析。结果表明，与对照组相比，感染组共存在条差异表达的蛋白条带，将条蛋白胶条带进行串联质谱分析，鉴定出个（位与蛋白相互作用的宿主蛋白，这些蛋白主要与蛋白翻译、病原致病、信号传导等细胞通路存在密切的关系。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，蛋白，宿主细胞蛋白，相互作用，生物信息学引言猪繁殖与呼吸综合征病毒（的蛋白是一种高度保守的主耍结构蛋白，不同每株间蛋白氦基酸同源性高达，而且欧、美型毒株间同源性为。尽管如此，但用针对蛋白的特异性单克隆抗体仍然可以鉴定山各型毒株间蛋白的抗原性差异。此外，已有研究表明，基因型毒株蛋白第位的天冬氨酸突变为天冬醜胺可能与疫苗病毒的毋力致弱有关在病毒粒子中，蛋白和蛋白以异源二聚体的形式存在，这对于动脉炎病毒的感染性是必须的】。最重耍的是，蛋白与蛋白组成复合体能与肝素结合，表明复合体有助于与表面的肝素样受体结合。然而，除上述功能外，蛋白是否还具有其他功能？因此，进一步探讨蛋白的生物学功能是有意义的。以病毒蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用作为切入点，分析病毒蛋白在其复制调控和致病机制中的作用已成为近年来病毒学领域的重要研究课题。我们前两章已经制备出了蛋单克隆抗体，并鉴定出所识别的表位。本章旨在利用单克隆抗体进行免疫共沉淀，结合串联质谱技术，蹄选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，并对蹄选出的蛋白进行亚细胞定位及功能的生物信息学分析，为深入研究蛋白的生物学功能奠定工作基础。材料与方法实验材料细胞与病毒细胞和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株由本实验室保存，细胞用含有的培养液于°、培养箱中培养。主要试剂和耗材购自公司；裂解液、和上样缓冲液购自碧云天生物技术研究所；购自南京金斯瑞生物 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析科技有限公司；蛋白单克隆抗体见第二章；丨购自公司；膜购自公司；脱脂乳购自公司；考马斯亮蓝购自公司；购自公司。细胞培养试剂培养液：购自公司，°保存备用》胎牛血清（购自公司，。保存备用。生长培养液：于溶液中加入°的，°保存备用》维持培养液：于溶液中加入的。保存备用。：加，加热完全溶解后，定容至室温保存。胰酶溶液：胰酶，溶于中，调至过滤除菌，分装，°保存备。蛋白质电泳相关溶液丙稀敢胺：购自康润生物）公司，°保存备。过硫酸钱：将过硫酸铵溶解于中，分装后于°保存备用。：将溶解于中，用浓调值至再用将溶液定容至，置。保存备用。将溶解于中，用浓调值至，再用将溶液定容至，置°保存备用。：将〗溶于中，室温保存。电泳缓冲液：称取、甘氛酸、加入约揽拌溶解，加定容至室温保存。考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝，置于烧杯中；量取的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入的冰醋酸，搅拌混勾；加入的去离子水，搅拌混匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存。相关溶液蛋白转印缓冲液：称取甘氨酸、、加的，充分搅拌溶解，加入的甲醇，定容至，室温保存。封闭液：脱脂乳，用配，现用现配。溶液中加入混匀，室温保存。主要仪器设备系列二氧化碳培养箱，购自美国公司；高速冷冻离心机，购自德国公司；小型台式高速离心机，购自德国公司；旋转混勾器，购自美国精骐公司； 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析超低温冰箱，购自海尔公司；基础电泳仪和高电流电泳仪，购自美国公司；半干转印槽，购自美国公司近红外焚光扫描成像系统，购自美国公司。实验方法细胞培养与病毒接种将细胞用胰酶消化成单个细胞后，以约个的细胞密度接种于细胞培养瓶，、°以饱和湿度下培养至形成左右的细胞单层。小心吸弃上清，将以的剂量接种细胞，°吸附后，吸弃病毒液加入维持培养基继续培养，同时设立空细胞对照。免疫共沉淀（提取细胞蛋白：用预冷的洗潘细胞两次，最后一次吸干，加入预冷的细胞裂解液（含的和的；细胞瓶），将细胞裂解物转移至冰上预冷的无菌的管中冰上裂解°离心上清取少部分做，其余用于。样品除杂：准备用洗两遍珠子，每次离心然后用配制成浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；每总蛋白中加入的琼脂糖珠，°摇晃，以去除非特异性遠！蛋内，降低背景；°离心将上清转移到一个新的离心管中。蛋白、抗体和的结合：加入一定体积的（单克隆抗体到总蛋内中，°缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；加入琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，°缓慢摇动抗原抗体混合物；离心，弃上清，用洗漆次，弃上清。电泳：用上样缓冲液将琼脂糖珠抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，沸水煮以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳。及分析制胶：按比例配置的分离胶和的浓缩胶，待胶完全聚合后，安装到电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液；加样：分别取适量的蛋白和待检的样品加入到胶的加样孔内，调适当的电压进行电泳，一般浓缩胶用，待样品跑到浓缩胶与分离胶的交界时，将电压调为继续电泳，直到溴紛蓝到达胶的底部时即可停止电泳，样品用于考马斯亮蓝染色，样品用于分析；转印：按胶的大小剪好膜和滤纸，放入转膜液中，将膜、胶和滤纸在转膜液中浸泡按照滤纸、膜、胶和滤纸的顺序依次从卜向上放好，使膜位于止极，胶位于负极，赶走气泡，在的电压下转印 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析免疫反应：转膜完成后，取出膜放入脱脂乳中室温封闭或°过夜，弃去封闭液，洗膜次，每次将膜放入单克隆抗体上清中室温解育洗膜次，再将膜放入倍稀释的红外突光二抗中室温孵育洗膜次；显色：将膜放入近红外焚光扫描成像系统中，扫描成像。蛋白质串联质谱切取条带：将感染组和对照组差异的条带用干净的刀片切下，放入的离心管，°保存；脱色：凝胶样品管中加入脱色液（清洗脱色至透明，吸弃上清，冻干；还原和烧基化：加入°孵育；吸弃上清，加入暗处孵育；酶切：吸弃上清，加入室温孵育吸弃上清，加入°。后吸弃冻干，加入溶液，在°条件下反应左右；抽提转移酶解原液至新的管中，之后凝胶中加入抽提液八〔丁八），超声；质谱：将抽提的肽段用型质谱仪（进行质谱分析。生物信息学分析注释使用软件通路注释采用数据库；蛋白互作图谱采用数据库和软件生成。结果与分析与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的蹄选将以的剂量接种细胞，同时设立对照细胞，接种后收取细胞样品，用蛋白单克隆抗体和进行免疫共沉淀，获得的样品进行、考马斯亮蓝染色及分析。结果显示，感染组和对照组相比共存在条差异蛋白条带（图且对照成立（图，分别切取这条差异条带，进行质谱鉴定。与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的质谱鉴定将条蛋白胶条带进行串联质谱分析（分析，鉴定出个（与蛋白相互作用的宿主蛋白（表。 中国农业人学博丨学位论文第叫章站繁辨。乎吸综含征病毒组白相互作用的宿主进的蹄选分析】”二：—竭一，參，⋯§麵”拿打图丨与蛋白互作的宿主蛋白的及分析（：￡质分了质标准；感染；对照表与蛋白相互作用的宿主蛋白‘丨‘ 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析， 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析】‘— 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与分析丨，】， 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析，， 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与分析 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析， 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的生物信息学分析注释 巾农业大学博十学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相作用的棺主蛋白的蹄选与分析针对鉴定出的个勾蛋内相互作的宿主蛋白，进行功能注释分析。生物学过程分析结果显示，与蛋白互作的棺主蛋白主耍参与细胞过程、新陈代谢过程和单有机体过科等（图。细胞组成（分析结果显示，与蛋白互作的宿主蛋白主耍分布丁细胞内、细胞器、人分复合体、膜和膜附着腔等（图。分功能（分析结果显示，与蛋白互作的宿主蛋内土耍具存结立能力和催化活性（图。——‘；一丨抓別￠：：■—■’。。’俯一口吨一一—二图与蛋白互作宿主细胞蛋白的功能注释分析生物学过程；细胞组成：（分功能代谢通路注释利数据序对鉴定山的个的宿主细胞蛋白进行分析，以确定与蛋白作的宿主细胞蛋内所参与的主耍生化代谢和信分转导途径。分析结果显示，与蛋内互作 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与分析的宿主细胞蛋共参与条相关通路（表，主要有核糖体通路、吞体通路、内质网蛋白加工通路、病原性大肠杆菌感染通路、剪接体通路和糖酵解通路等（图。表与蛋白互作宿主细胞蛋白的通路分析 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析丨丨 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选分析】， 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析丨丨 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析 巾农业大学博十学位论文第四章与猪繁与呼吸综合征病崔蛋白相互作的指主蛋白的蹄选与分析———一；“冊丨！气”务”口“么图与蛋白互作宿主细胞蛋白的通路分析蛋白质相互作用网络分析利川差异表达蛋内质的，通过汽旬数据序，确定标蛋内之间的相互 巾农业大学博十学位论文第四章猪繁殖与呼吸综合征病邊蛋白相互作的棺主蛋白的筛选与分析作图和与之直接作用的其他蛋内质（图，并利软件生成相作网络。”’咖糊。〔级細■：■、卿战‘‘丄，■““、、卞。讲一、一—上：’，‘‘载：編霸，電广滅：：避‘‘糾以，侧，、一——，咖咖“■二‘评】，，■明；■即》狀， 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析图与蛋白互作宿主细胞蛋白的互作图谱差异表达蛋白的相互作用网络；（差异表达蛋白与其他蛋白的相互作用网络注：其中黄色节点为差异表达蛋白质，蓝色节点为与差异表达蛋白直接相互作用的蛋白质。讨论蛋白在病毒复制、包装、出芽以及与细胞受体结合等多方面发挥着重要的生物学功能，在发挥以上生物学功能的过程中，需要大量宿主细胞蛋白的参与。因此，本研究通过蹄选与蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，利用生物信息学分析与其互作蛋白的功能，有助于探索蛋白的生物学功能及其发挥功能的分子机制。利招免疫共沉淀结合串联质谱的方法，本研究共鉴定出个与蛋白互作的宿主细胞蛋白。为了更全面、准确的分析与蛋白互作宿主细胞蛋白的功能，我们对这个蛋白进行了相关生物信息学分析。分析结果显示，大量的与蛋白互作宿主细胞蛋白主要与核糖体通路、吞唆体通路、内质网蛋白加工通路、病原性大肠杆菌感染通路、剪接体通路和糖酵解通路相关。其中核糖体通路、内质网蛋白加工通路和剪接体通路与蛋白质的合成有关，由此可以推测，病毒进入宿主细胞后，利用宿主细胞的翻译系统来完成自身蛋白的合成。已有的研究结果表明，侵入宿主细胞后，首先利用宿主细胞的翻译系统，合成由和编码的多聚蛋白和，然后通过自体剪切形成非结构蛋白及复制转录复合体，通过复制转录复合体合成亚基因组再由亚基因组翻译产生病毒的结构蛋白从本研究中，我们可以看出蛋白与宿主的蛋白翻译系统密切相关，因此进一步证明蛋白在复制过程中发挥关键作用。注释显示，一些与蛋白互作宿主细胞蛋白位于膜结构上并且具有结合能力。因此，蛋白可能与宿主细胞膜上的蛋白结合。已有的研究结果表明，肝素处理的再去感染细胞，基因型和基因型的感染率分别下降和用肝素酶处理的明显地降低了的感染，利用肝素亲和层析的方法鉴定出了蛋白和蛋白能够结合肝素，进一步鉴定与形成二聚体与肝素结合，而蛋白作为同源二聚体与肝素结合丨。因此，本研究进一步证明了蛋白可以结合宿主细胞膜蛋白。另外，一些与蛋白互作的宿主蛋白与几种传染病（单纯疱疫病毒、病毒、禽流感病毒和人类嗜细胞病毒）密切相关，这一结果提示我们与其他病原在致病过中存在相同或相似的机制，因此，在进行的相关研究时，我们可以借鉴其他病原的研究方法或研究结果。还有些蛋白与信号通路有关，如信号通路、信号通路、甲状腺激素信号通路和信号通路，但作用于这些通路的分子机制还尚不清楚，有待于进一步研究。 中国农业大学博士学位论文第四章与猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的蹄选与分析小结利用免疫共沉淀（结合串联质谱（分析的方法，共蹄选出个与蛋白互作的宿主细胞蛋白。对个与蛋白互作宿主细胞蛋白进行了生物信息学分析，表明所蹄选出的蛋白主耍与蛋白翻译、病原致病、信号传导、膜结构等密切相关。 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响摘要：将分别携带和的真核表达载体共转染细胞，利用免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证了蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用和共定位情况。将感染细胞，利用蛋白单克隆抗体进行免疫共沉淀，在免疫复合物中也能检测到蛋白，表明蛋白和蛋白在病毒感染情况下也具有相互作用。此外利用沉默细胞中基因的表达后再感染采用和病毒滴度测定分析对增殖的影响。结果表明，抑制的表达能降低子代病毒的产量和病毒蛋白的表达，提示宿主细胞蛋白参与的复制。关键词：，蛋白，蛋白，增殖引言我国出现以编码区缺失个氨基酸为分子特征的高致病性，并引起的严重型导致感染猪群的高发病率和高死亡率，对我国养猪业造成了巨大的经济损失，并引起了国务院和农业部的高度关注高致病性流行范围广、传播速度快，发病猪群体温升高（°，不同日龄、不同品种的猪均可发病等尽管推测编码区不连续个氨基酸的缺失可能与病毒毒力增强有关但随后的研究证明个氨基酸的缺失不是高致病性毒力增强的主要因素】，而最新的研究结果证实和是高致病性致死性毒力决定基因近年来，除了以上非结构蛋白参与病毒的致病性研究外，非结构蛋白与宿主蛋白相互作用的分子机制己成为国内外学者的研究重点在结构蛋白与宿主细胞受体的研究中，揭示了异源二聚体中的蛋白和蛋白通过结合细胞的硫酸乙醜肝素从而吸附细胞病毒的内化则通过复合物结合巨嗟细胞上的唾液酸粘附素以及和结合完成的丨。通过酵母双杂交蹄选和细胞的文库，鉴定了结合蛋白和家族域蛋白的抑制因子与的蛋白结合，进而它们分别参与了病毒复制和可能调节宿主基因的表达，】。另有学者通过技术筛选了与的蛋白相互作用的蛋白，主要是合成机械特别是翻译起始水平，还有后转录修饰机械然而，的其他结构蛋白与宿主蛋相互作用的研究相对较少。在上一章的研究中，我们通过的方法蹄选了与蛋白互作的宿主蛋白，通过查阅文献确定又称为为进一步研究的对象。先前的研究结果表明能够调节基因的转录它能够和另一个核因子或者形成稳定的异源二聚体【，。更多的研究集中于异源蛋白复合物上，它主要位于细胞核内，但也位于其他类型细胞的细胞菜内除了作为转录的辅助因子外它还参与的输出和介导的稳定和转录另外在细胞核内，复合物可以作为加工途径的负调节因子。。最近的研究结果表明，和参与 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与帘主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响了许多病毒的复制过程。在黄病毒科中的和研究中，发现宿主细胞蛋白和是病毒复制机械的一部分，提示它们能够调节病毒基因的翻译和的复制丨丨在微病毒中，已有研究表明能够结合嵌合脊髓灰质炎病毐的并且在神经元衍生的细胞中和共同能够抑制病毒基因的翻译丨。和还能分别和的结构蛋白和流感病毒的蛋白相互作用，下调它们的表达均能促进病每的复制在复制过程是否爲有相似的作用值得研究。闪此，本章进一步分析蛋白与的相互作用以及对病毒复制的影响。材料与方法实验材料细胞、病毒、质粒和菌株细胞、细胞、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株和真核表达质粒丨、空载体由本实验室保存，细胞含有的培养液于°、培养箱中培养；真核表达载体购公司；、和购自公司；感受态细胞购北京全式金生物技术有限公司。主要试剂、耗材及试剂盒膜（购自公司；玻底培养皿购自公司；以下简称、、、、、甘油、、、多抗和购自公司；购自公司；购康润生物）公司；、、、和购自公司；购公司；购自公司；和购公司；裂解液、和上样缓冲液购自碧云天生物技术研究所；购南京金斯瑞生物科技有限公司；购自公司；购自公司；多聚甲酵和购北京索莱宝科技有限公司；单抗和单抗购自哈尔滨海基生物科技有限公司；购日本同彳二化学研究所；单抗和单抗购自公司；无内毒素质粒大提试剂盒购天根生化科技（北京）有限公司。细胞培养试剂培养液：购自公司，°保存备用。胎牛血清（购自公司，。保存备用。 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响生长培养液：于溶液中加入的°保存备用。维持培养液：于溶液中加入的，°保存备用。：，加加热完全溶解后，定容至室温保存。胰酶溶液：胰酶，，溶于中，调至，过滤除菌，分装，°保存备用。细胞裂解液：先配成称取然后用调至先配成称取，然后用调至先配成称取先配成称取分别加入、、、甘油、再加入充分溶解后定容至，使其各成分终浓度分别为、、、的甘油、。的，°保存备用。临用前加终浓度为的和的病毒保存液：鹿糖，甘露醇加水溶解至调节至，过滤分装°保存。蛋白质电泳相关溶液丙稀酜胺：购自康润生物）公司，°保存备用。过硫酸铵：将过硫酸铵溶解于中，分装后于°保存备用。将溶解于中，用浓调值至再用将溶液定容至置°保存备用。将溶解于中，用浓调值至再用将溶液定容至，置°保存备用。；将溶于中，室温保存。电泳缓冲液：称取、甘氨酸、加入约撹拌溶解，加定容至，室温保存。相关溶液蛋白转印缓冲液：称取甘氨酸、、力口的，充分搅拌溶解，加入的甲醇，定容至，室温保存。封闭液：脱脂乳，用配，现用现配。：溶液中加入，混匀，室温保存。一抗稀释液：购自碧云天生物技术研究所。主要仪器设备系列二氧化碳培养箱，购自美国公司；高速冷冻离心机，购自德国公司； 中国农业大学博上学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响小型台式高速离心机，购自德国公司；超低温冰箱，购自海尔公司；型三孔电热恒温水槽，购上海一恒科技有限公司；倒置突光显微镜，购自日本公司；基础电泳仪和高电流电泳仪，购美国公司；半干转印槽，购美国公司；近红外突光扫描成像系统，购自美国公司；仪，购德国公司；核酸电泳仪，购￡北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像系统，购美国公司；恒温培养摇床，购自上海福玛实验设备有限公司；超净工作台，购公司；分光光度计，购公司；超速离心机，购美国公司；型低温连接仪，购珠海黑马医学仪器有限公司；酵标仪，购自瑞士公司。实验方法扩增猪基因总的提取：使用进行操作，步骤如下，将细胞复苏后离心，洗一遍，加入合适体积的已加，泥旋；将裂解液转移至预装收集管的中，离心；弃去柱子，保留收集液，加入等体积的的无水乙醇泥匀；转移样品至预装收集管的离心弃去液体；加入至离心弃去液体；加入至离心弃去液体；加入至离心弃去液体；将置于新的收集管，离心丨，使膜干燥；将置于新的收集管加入离心，收集洗脱液，分光光度计测定浓度，°保存。反转录：在微量离心管内配制下列反应液，全量为 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响轻轻拨拌；室温放置后移入°恒温槽中；。保温在冰水中冷却所得到的反应液可用于反应。按下列组成配置反应液，建立反应体系：上游引物（下游引物（反应条件：°°。°。重复个循环产物经的琼脂糖电泳分离后，将符合预期大小的目的条带切下，使用的胶回收试剂盒进行回收。质粒构建将上述回收产物与真核表达载体用和双酶切，胶回收之后用连接酶连接，转化，鉴定测序。然后以为模板扩增构建以为模板扩增构建，所用引物见表。质粒提取用的无内毒素质粒大提试剂盒，具体操作按照说明书进行。 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响表真核表达载体构建所用引物引物序列（’’构建构建包构建包注：代表正向引物，代表反向⋯物；酶切位点用斜体表不；终止密码了用加粗表真核细胞转染转染前一天接种细胞至培养皿，每孔细胞数个，转染时的最佳密度为然后按照说明书进行操作：将、质粒与稀释液（平衡至°，短暂镟祸混匀用稀释液将质粒稀释至终浓度为质粒（种）培养基，轻柔混匀；将直接添加至含稀释质粒的培养基中，切勿接触到塑料管壁，轻柔泡合；°下孵育转染试剂质粒复合物从培养箱中取出细胞培养板，无需弃去生：培养基，将转染复合物逐滴加至细胞中继续培养收获细胞。免疫共沉淀提取细胞蛋白：用预冷的洗潘细胞两次，最后一次吸干加入预冷的细胞裂解液（含的和的；培养皿），将细胞裂解物转移至冰上预冷的无菌的管中冰上裂解°离心取少量上清作为丨其余用于酶处理：将细胞裂解液加至终浓度室温作用，取少量跑核酸电泳，剩余样品做和；与蛋白的结合：向蛋白样品中加入丁缓慢摇动°离心弃上清，用细胞洗涤液洗潘°离心，重复次；分析：洗漆最后一次剩余约和细胞洗涂液，加上样缓冲液沸水煮离心上清用于和分析；内源性免疫共沉淀：将按丨感染细胞，收获细胞，同时设未感染对照组，其余步骤同。 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响激光共聚焦铺板：将细胞以约个的细胞密度接种至玻底培养皿，每孔置于、°细胞培养箱中培养过夜；转染：用转染试剂将相应的质粒转染至细胞，转染步骤同固定、透膜和封闭：转染后弃去培养液，用将细胞洗次，每次加入多聚甲酸室温固定，洗次，加入室温透膜，洗次，加室温封闭洗次；一抗：加入倍稀释的单抗和多抗，°孵育，洗次；二抗：加入倍稀释的羊抗鼠丨和羊抗兔°孵育，洗次；染核：加入丨室温舺育，洗次；拍照：用激光共焦观察结果并拍照。干扰设计与合成：针对基因的个点进行设计。由上海吉玛公司负责设计和合成，序列见表表的序列’）的转染：使用转染试剂将转染至细胞，具体步骤按试剂说明书进行。转染前一天接种细胞至孔培养板中，每孔细胞数个，使转染时细胞的汇合度达到转染时向个无的离心管中各加入无血清培养基），然后分别加入和的轻轻均勾，将稀释的加入到转染试剂中，室温舺育然后将复合物逐滴加入至培养板中，置°培养箱中继续培养，收集细胞，用检测干扰效率。慢病毒包装包装质粒的提取：使用的无内毒素质粒大提试剂盒提取高浓度、高纯度的慢病毒包装所用质粒，具体操作按照说明书进行。细胞的培养：将细胞用胰酶消化成单个细胞后，接种于细胞培养皿，使用含有的培养基于、°培养箱中培养过夜，至细胞单层达到即可以进行包装质粒的转染。 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影晌慢病毒载体的转染：按比例将表达基因的载体和辅助载体、混合后，用转染试剂将三质粒共转入细胞，转染步骤按说明书进行，同时设立对照组。病毒纯化：后将细胞上清收集于离心管中，离心用的滤器将上清过滤，然后用超速离心机进行离心，°离心。离心结束后，将上淸倒掉，加入适量的病毒保存液，泡匀后分装，置于°保存。慢病毒转导：以将慢病毒感染细胞，并加入终浓度为混匀，后收集细胞进行后续试验。法检测细胞活性将待检测细胞和对照组细胞接种于孔细胞培养板于检测前每孔加入的继续于细胞培养箱中培养。置于酶标仪上进行检测，波长为病毒毒价测定将细胞消化后，以约的密度铺入孔细胞培养板，每孔，放置于°含的培养箱中培养，当形成左右的细胞单层时，将病毒液以培养基进行倍递进稀释，取稀释度接种细胞单层，每个稀释度平行接种个孔，每孔，°培养箱继续培养，培养后，记录每个梯度的孔数，根据法计算病毒的。数据的统计与分析利用对实验数据进行成对检验来比较，为差异显黑：，成为差异极显著，为无显著差异。所有实验数据以平均值土标准方差表示。利用软件对实验数据进行作图。结果与分析真核表达载体的构建首先提取总，然后采用方法扩增基因，其大小为图，将产物胶冋收，并与真核表达载体同时用￡和恐双酶切，产物胶回收之后用进行连接构建重組质粒经单双酶切及鉴定（图正确后送测序，结果显示勾参考序列相比无氨基酸的突变。 中农业大学博学位论文笫五苹资与宿主道的相互作用及』对病毒增妨的影响隣翔隱图的扩增及重组质粒的鉴定分了质标准；：产物；申海切；和双切；接定￡免疫共沉淀验证蛋白与在细胞中的相互作用为了验证蛋白与之间的相互作，将构建的和实验宝已保存的共转染细胞，同时设立空载体对照，转染后收取细胞蛋白，取少部分做对照，其余做免疫共沉淀，叩样品和样品分别单抗和单抗进行检测。结果显示，蛋内和在转染后都能得到表达，沉淀蛋内相互作丨丨复合物中能够检测到，而在对照转染组中未检测到相应条带，说明蛋内与在细胞中存在相互作图；相反，将和上的标签和标签互换，构建和，然共转染细胞进行免疫共沉淀，结果显示，沉淀相互作复合物中能够检测到蛋内，进一步证实了蛋内勾王细胞中存在相互作图。￡细胞中蛋白与的相互作叫娃在转染质粒过表达的情况下发生的，而进一步证实在病毋感染的条件下蛋白是否与内源性的相是十分必要的。宵先，将接种细胞，同时设立对照组，收取细胞蛋单抗进行免疫共沉淀，沉淀复合物分别用单抗和单抗进行检测，结龙显示，蛋内单克隆抗体沉淀得到的蛋内复合物中可以检测到内源性的，而在对照组中未检测到相应条带，说明蛋内与细胞中的内源性存在相互作用（闻。由能够介导的稳定性和翻泽，那么蛋白之间的相互作否是由丁‘非特异性的桥迹作呢？我们将共转染和的细胞的细胞裂解液室温育取少髮跑核酸屯泳，其余丁【。结果显示，处理后仍能检测到卜来的阁，表明蛋內勾之间的相互作不是由丁 中农业人学博：学位论文第五章进宿主饭的相互作用及对病毒增殖的影响介导的。——“紀姜‘於令姆满、，⋯‘：丨■丨丨“：義警※，—、⋯二觀霧——、。俞—■夢「識丨‘图免疫共沉淀验证蛋白与的相互作用 十农业大学博十学位论文第草蛋白与宿主蛋白的相作及其对病遂增娘的影响激光共聚焦验证蛋白与在细胞中的相互作用利用激光共聚焦分析蛋内与在细胞中的定位情况。宵先，我们将构建好的和共转染细胞，同时设立对照组，转染后进行免疫黄光染色和激光共聚焦观察。结果显示，蛋白和都分布丁细胞质中，共转染细胞时能在细胞质中共定位，并现点状聚集（图。■■■■■■■■图蛋白与在细胞中的共定位分析（感染对表达的影响以个剂的接种细胞，同时设立不感染病毒的对照组，感染后在不同时间点提取细胞蛋內进行分析感染对表达的影响。结果显示，在感染的细胞，蛋白的表达在和达到高峰，的表达水平无论是在对照组还是感染组都没有明显的变化（图，说明感染对细胞蛋内的表达没有影响。 屮农业大学丨専十学位论文第章蛋白与棺主蛋白的相作及其对病毒增殖的影响“丨一丨■丨图感染细胞中表达分析干扰对増殖和蛋白表达的影响利技术干扰细胞的表达，后采检测设计的对干扰序列（、、的干扰效率。结果显示，所用的对干扰序列均能明显抑制的表达（图，闪此将任意一对丁后续试验。利用干扰技术特异性地沉默的表达，然后接种，通过和分别检测病毒感染后、和的培养上清中病毐滴度和病毒蛋内的表达，分析对病毒增殖的影响。结果显示，转染组的戈病耍产在以上个时间点均比对照组明显降低（图，而时未检测到病毒蛋白的表达，时，转染的蛋白的表达勾对照组相比略有降低，时转染组和对照组的蛋内的表达没有差异（图。过表达对增殖的影响沉默对的增殖存抑制作那么过表达是否对的增殖存促进作呢？宵先将慢病毒载体共转染细胞，并将慢病毒纯化，通过系列稀释感染细胞汽炎光细胞数确定病毒的滴度，按照不同的感染，通过观察转导效率和测定细胞活力细胞来确定最佳的，结果显示，在时，病岛的转导效率能达到并且细胞活力并无明显差异（图和。将慢病毒和对照病毋按上述条件感染细胞，结果显示，分布丁细胞质和细胞核，而主耍分布丁细胞核（图显示，外源性可表达，而内源性与对照组相比略有降低（图。将慢病毒转导细胞后接种，在不同时间点收获培养上清测定结果显示，与对照组相比，过表达沖不影响病毒的增殖（图。 巾农业大学博十学位论文第五章蛋白与棺主蛋白的相作及其对病毒增姐的影响本本曰而、孩翁：资一一—；—一“職桑图干扰对增殖和蛋白表达的影响 巾农业大学博十学位论文第五章蛋白与指主蛋白的相互作及其对病毒增殖的影响放大倍数，■「■国—一二§兩四⑴四■》丨、；；：■：：■：■：：■■■■■■■、■■■■■■一备—■、■——■試图过表达对增殖的影晌讨论在一章研究中，我们通过的方法蹄选了许多与蛋内相作的宿主蛋内，本章中我们先同时构建了儿种真核表达载体，并在细胞中验证是否与蛋白相互作用，同时杏阅文献确定了为主耍研究祀蛋内。符先，我们在细胞中过表达蛋内和蛋白，利丨免疫共沉淀的方法验证了两者存在相互作，且不受真核表达载体的影响（閱和图。仍这只娃在两种蛋内过表达的情况卜得到的结果，那么在病毒感染细 中国农业大学博士学位论文第五章蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对病毒增殖的影响胞的情况下是否也能检测到蛋白与蛋白具有相互作用呢？我们将感染细胞，利用单抗做免疫共沉淀，结果显示在免疫复合物中能检测到内源性的图，说明在病毒自然感染的细胞中，蛋白和蛋白存在相互作用。而且用处理细胞裂解液，然后进行，蛋白都能沉淀山蛋白，说明两者之间的相互作用不是依赖于的（图。为了更直观地展示两者之间的相互作用，我们又利用了激光共聚焦技术观察蛋白和蛋白在细胞中的定位情况，发现单独转染定位于细胞质中，共转染蛋白和蛋白，两者在细胞质中发生共定位并呈现点状聚集（图，而后由于并没有找到能做的多抗，所以并没有在病毒感染细胞中检测到两个蛋白的相互作用。之前的研究结果表明蛋白参与许多病每的复制，它能够从细胞核向细胞质中的复制位点移位，并且与的、和发生共定位，的胞衆聚集并不依赖于干扰素的产生，免疫共沉淀也证实了他们之间的相互作用，并且干扰的表达能够增加病毒粒子的产生，但具体机制并不清楚并且在和感染细胞中，能够结合它们的’和’使得基因组两端能够靠近，这也是和复制的先决条件。而其异源二聚体蛋白能够与流感病毒的蛋白相互作用，并且负调控流感病毒的复制⑴。等人发现在脊髓灰质炎病毒（基因组中插入了异源的人的鼻病毒丨型（的阻断了病毒在神经元细胞中的翻译和增殖，然而却极大促进了其在癌细胞中的增殖⋯，究其原因发现是蛋白与神经元细胞而非癌细胞中的鼻病毒的相互作用，并且沉默促进了其在神经元细胞中的增殖而后又发现和在神经元细胞而非神经胶质瘤细胞中形成二聚体，并能与神经元细胞中病毒的结合，阻止启动的病毒翻译〖”°。为了进一步阐明对增殖的影响，我们利用技术干扰了细胞的的表达，分别对细胞内病毒蛋白和细胞培养上清的病毒滴度进行测定。结果表明，干扰细胞内的表达可以显著降低子代病毒的产量（图，并且在的蛋白的表达也略有降低（图。然而，过表达并没有增强病毒的增殖（图表明在复制中扮演者不可或缺的角色。综上所述，本研究鉴定了蛋白与宿主蛋内具有相互作！进一步证实了在复制过程中是不可或缺的。此研究为深入研究蛋内和蛋白在增殖过程中的作用提供了科学依据，同时也为与宿主蛋白相互作用的分子机制奠定了基础。小结利用免疫共沉淀验证了蛋白与蛋白在体外转染和病毒感染的情况下存在相互作用。利用激光共聚焦分析了蛋白与蛋白在体外转染细胞时能够发生共定位。利用技术干扰细胞中的后能显著抑制的复制。 中国农业大学博士学位论文第六章结论第六章结论以纯化为免疫原，釆用杂交瘤细胞技术制备出株高效价的蛋白单克隆抗体和，具有良好的特异性可分别识别蛋白的细胞线性表位和。采用免疫共沉淀（结合串联质谱（分析技术，蹄选出个与蛋白互作的宿主细胞蛋白，主耍与蛋翻译、病原致病、信号传导、膜结构等密切相关。应用免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证了蛋白可与宿主细胞蛋白相互作用，且沉默细胞中的能显著抑制的复制。 中国农业大学博士学位论文第七章创新点第七章创新点鉴定出存在于蛋白的个新表位和丰富了蛋白的抗原结构。首次筛选出与蛋白互作的宿主细胞蛋白，并绘制出蛋白互作图谱，为深入研究蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的分子机制及其生物学意义提供了重耍线索和依据。证实了蛋白与宿主细胞蛋白具有相互作用，并揭示了在增殖中的生物学意义，为的复制调控机制提供了有价值的科学依据。 中国农业大学博士学位论文第八章文献综述第八章文献综述猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白的功能及其与宿主蛋白的相互作用猪繁殖与呼吸综合征病毒（猪繁殖与呼吸综合征（是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（，引起的一种猪的病毒性高度传染性疾病，临床表现主耍以妊娠母猪发生流产、早产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪出现呼吸困难为特征丨，。该病于年首次在美国发现，年在德国暴发，随后蔓延至欧洲各国随后儿乎遍布全球所有养猪的国家和地区，给全球养猪业造成了巨大的经济损失丨。我国于世纪年代中期发生该病【，〗，随后该病广泛地流行于全国各地【并成为严重位害我国母猪繁殖障礙和仔猪呼吸道疾病的主耍疫病之一。年，我国爆发了由以编码区缺失个氨基酸为分子特征的高致病性引起的严重型，导致感染猪群出现高发病率和高死亡率，使我国养猪业经历了前所有的浩劫目前已成为我国危害养猪业的主耍疫病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毐归类于套式病毒、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属（，同属的成员还有马动脉炎病毒（，、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（丨，和猴出血热病毒（的基因组为不分节段的单股正链全长约具有帽子结构和尾，’端和’端各含有一个非编码区（，至少含有个开放阅读框（，包括、、、和最近发现的的和共山基因组的，编码病毒的复制酶多聚蛋白和多聚蛋内通过剪切产生至少种非结构蛋白（丨、、、、以及最近发现的【。编码病毒的结构蛋白，由亚基因组表达其中蛋白负责包裹病毒，还有几种膜蛋白嵌入病毒的囊膜中，包括糖基化蛋白（、、和、非糖基化蛋白（和利新发现的蛋白。其中、和是病毒粒子的主耍成分，、、和是病毒的次要结构蛋白，可能是病毒非常次要的成分其中以二硫键相连形成异源三聚体，而与形成异源二聚体图。还有结果表明，用免疫电镜可以观察到不同毒株的病毒粒子表面的蛋白，分析也证实了存在于病毒粒子表面，并显示出了的不同亚型，因此推测存可能作为一种结构蛋白参与病毒粒子的组成丨。基于血清学和基因组序列的差异，分为以欧洲型毒株为代表的基因型和以美洲型毒株为代表的基因型。里然这两种基因型的毒株感染所致疾病的临床特征基本一致，但两者在基因组、抗原性等方面存在明显差异】。大量的研究结果表明，基因组变异现象在同型毒株之间非常普遍—方面与病毒基因组本身的复制特性以及具有准种特征有关丨、另一方面与不同毒株间的重组有关二】，从而导致毒株的多样性的变异的复？性。 农业大学博十学位论文第八章文献综述、—么。。；“—力丫、、图的结构】的病毒粒结构图；（膜蛋白知；合物图膜蛋白主耍囊膜蛋白；合物（蓝色和橙色）、次要囊膜蛋白髮；合物（绿色、红色和紫色）、小疏水蛋白深蔽色）和蛋白（黄色）。的主要结构蛋白的蚩白为不含信兮肽、非糖基化的蛋内，成熟的蛋内在基闪项和基闪耍株中分别为和此差异是由丁人量核酸的置换、插入和缺失造成的。蛋白相对保守，基闪别毐株间氨基酸的同源率为，基因嘲逛株间氨基酸的同源率为基闪项和基闪耶间的同源性仅为，但在间抗原性高度相似猪感染后会产生很强的针对蛋内的免疫应答，且持续时间。在病毒复制过中， 中国农业大学博士学位论文笫八章文献综述不论基因型还是基因型毒株，蛋由均定位〒细胞或细胞的胞浆与核仁蛋白是一个等电点约的碱性蛋白，具有很强的免疫原性，在丝氨酸可发生憐酸化，蛋白转移到高尔基体（套式病毒的成熟位点）后，由位的半耽氨酸通过二硫键形成同源二聚体并装配成核衣壳。蛋白从胞浆进入核仁是核定位信号（依赖性的。蛋白上至少存在个单独的功能区域，分为核定位、核仁定位、核输出（和胞菜保留域。其中包含一潜在的核定位信号、一个功能性的、一个核仁定位信号序列和一个可能的核输出信号基元（，。在病毒复制过程中，蛋白的使蛋白出现在细胞核内，调节核内的加工，蛋白上的和等，则涉及蛋白从核膜内外的穿梭转运，表明蛋白在核胞楽之间的穿梭是一个复杂的调节过程。另外，蛋白还可以与细胞膜上的穿梭蛋白结合，使蛋白穿梭并定位于核或核仁。蛋白是病毒粒子上含量最多的结构蛋白，也是免疫原性最强的蛋白。感染猪体后，血清中抗的免疫球蛋白主要是针对蛋的。基因型毒株蛋白上至少有个抗原表位，其中个是线性表位（，和个是构象表位（和蛋扫的也参与蛋白二聚体的形成此区域具有较强的亲水性并形成单抗识别的部分构象表位其中线性表位在欧美毒株间高度保守，结构预测表明，该区域处于转角与无规则卷曲的区域，极易形成良好的抗原表位。基因型蛋白至少有个抗原表位：三个线性表位（，和—个构象决定簇（以和为中心），其中是欧美毒株高度保守的线性表位，另外个（和是基因型特异性表位是变异最大的蛋白，人约’。在不同毒株间变异较大丨”，同殖毒株间氨基酸的同源率在之间，而基因型和基因型毒株间氨基酸同源率只有【。是最重要的结构蛋白，它暴露在病毒粒子表面，含有中和表位’。单抗能够中和细胞培养中的病毒感染，〗。】。在体内，大多数中和抗体主要是针对蛋白的用表达的基因工程疫苗免疫猪只也能产生针对的中和抗体怀孕母猪用恢复期的猪的高免血清免疫能够完全抵抗同源毒株引起的繁殖障碍，说明能够在体内提供免疫保护另一方面，仅有抗体并不能对同源病毒的攻提供完全保护。利用肽扫描技术发现主要的中和表位位于胞外区的中间域（使用猪血清和单抗鉴定出了胞外区一个非中和表位（表位）和一个中和表位（表位）。表位能够被中和性单抗和高效价猪的中和抗体所识别，它位于的，并且在分离毒株中很保守，但不是一个免疫优势区；相反，非中和性的表位（是一个免疫优势区。有趣的是，感染后首先产生表位的抗体，然后产生表位的抗体，因此，免疫优势的表位可能扮演诱骗表位的角色，所以延迟了针对表位的中和抗体反应而最近的研究结果表明，在高致病性中，表位并不是一个中和表位。蛋白含有一个信号肽（，一个胞外区（—个三次跨膜和一个亲水胞内区丨’。通过对火量基因型和基因型毒株序列的比对，鉴 中国农业大学博士学位论文第八章文献综述定出一个高变区（、两个变异区（和、三个保守区（、和和大量的潜在的糖基化位点第一个糖基化位点位于胞外区的高变区（或或，但不是所有或毒株都有，第二个和第三个糖基化位点位于的和或的和除了以上三个，在一些毒株中还有第四个糖基化位点（还有研究表明，通过对的去糖基化作用可以增强的免疫原性，并可提供对同源毒株的良好的保护、这种糖基化的遮蔽作用在许多病毒都存在，比如〗、丨，流感病毒【和。在以上的糖基化位点中，突变则不能产生病毒粒子，说明是病毒感染的关键因素，而突变另几个糖基化位点则只能降低病毒的滴度。这些突变毒株均增强了对猪中和抗体的敏感性，并且将突变毒株免疫猪产生了更高的中和抗体，表明胞外区糖基化位点的缺失增强了体内病毒中和作用和中和表位的免疫原性丨〗。在许多有囊膜的病毒中，囊膜蛋内都被糖修饰，糖基化的囊膜蛋发挥着多种多样的功能，比如受体结合、膜融合、穿透细胞及病毒的山芽等除了糖基化的遮蔽作用外，它还参与了抗体依赖性增强作用（，有利于病毒在巨啦细胞的感染。是利用特异性抗体和细胞的受体来介导病每的吸附和内化免疫大肠杆菌表达的能够感染的病例损伤，很可能是通过机制实现的和蛋白通过二硫键能形成异源二聚体，分别发生在位氨基酸残基和位氨基酸残基基因型），突变任何一个氨基酸都会完全阻断病毒粒子的产生，表明和的共价键结合对于病毒的装配是必须的丨和复合物能够和肝素结合显示了在病毒吸附肺泡巨哩细胞的作用，进一步证明和巨喷细胞受体唾液酸粘附素结合介导病毒的内吞蛋白还参与引起的细胞凋亡。，其诱导凋亡的区域位于端个氨基酸【、总之，蛋白在病毒感染宿主过程中起着至关重耍的作用。蛋白是一个由病毒基因编码的、、由或组成的型跨膜蛋白。它的结构由一个由个氨基酸组成的胞外区、三个连续的跨膜区和一个由个氨基酸组成的胞外区构成蛋白是非糖基化的结构蛋白，是动脉炎病毒最保守的蛋白，】。冠状病毒的蛋白有助子病毒的装配和山芽推测动脉炎病毒的蛋白也具有这样的功能在病毒粒子中，蛋白和蛋白以异源二聚体的形式存在，这对于动脉炎病毒的感染是必须的这些异二聚体位于感染细胞的内质网上或病毒装配过程中’’’。在中，和蛋白对于病毒粒子形成也是不可或缺的，并在此结构有助于稳定与受体结合的病毒吸附位点异二聚体中的蛋白和蛋白通过结合细胞的硫酸乙酰肝素从而吸附细胞病毒的内化则通过复合物结合巨唆细胞上的唾液酸粘附素以及和结合完成的。等人构建了三株复制缺陷的重组腺病毒（、和将其免疫小鼠，结果显示二免后两周产生特异性抗体和细胞免疫反应，然后免疫组比和免疫组产生较高的中和抗体滴度和较强的淋巴细胞增殖，表明蛋白能够增强产生中和抗体和细胞免疫反应的能力利用嗟菌体展示技术和感染后期的猪血清，鉴定出了基因塑蛋白胞内区的抗原表位位于⋯。之后利用肽扫描技 中国农业大学博士学位论文第八章文献综述术和份北美型感染的猪血清，蛋白的抗原表位又被鉴定出来，位于端胞内区的和，因此两段重叠的区域被认为是最小的抗体结合位点。最近的研究结果表明，以上两个表位区还存在两个新的抗原表位和。的研究进展又称白介素增强子结合因子丨，与同在核内的—起在转录水平调节白介素的表达【。广泛地存在于正常的组织中，尤其娃睾丸、脑和肾脏，主要都是分布在细胞核内；的表达在淋巴瘤白血病细胞系中是升高的。人和鼠的只有在位有个异亮氨酸的替换。焚光原位嵌交显示人的基因定位于染色体而鼠的定位于染色体〒。与能形成异源二聚体，它们最早也娃在激活的细胞系中作为结合在基因抗原反应识别原件（上的核因子被分离和发现的，的复合物能够结合基因启动子区域的抗原反应识别原件而调节白介素基因的转录在许多种细胞系中，和也是作为复合物共同存在的’’。’〗气的结构研究进展是双链结合蛋家族中的重要成员，由丨基因编码，一级序列由知个氨基酸残基组成。的氨基酸序列包括：个富含精氨酸和甘氨酸的结构域（、一个锌指结构域（，与蛋白家族具有同源性）和一个富含谷氨酸的结构域（与通过他们都有的结构域形成异源二聚体，其结构域与修饰酶的无模板核甘酸转移酶家族有着相似的结构，然而，和在进化过程中失去了关键的催化残基进而没有酶活性。的存在极火提高了分子的稳定性。中的与结合的残基在其他两个相关蛋内和中是很保守的。利用免疫共沉淀和定点突变技术验证了通过相同的接合处识别和表明与其他的含结构域的蛋白能形成多种细胞复合物。的功能研究进展复合物调节细胞中丨基因的表达能与组成蛋白复合物在多种水平上调节基因的表达此复合物首先是作为转录因子参与激活的细胞中基因的转录时发现的’。是由激活的细胞产生的，在细胞免疫应答中发挥着重要的作用，它具有活化细胞，刺激细胞增殖，增强杀伤活性及产生细胞因子，诱导细胞产生，促进细胞增殖和分泌抗体，激活巨唆细胞的作用。细胞在激活前能够抑制的表达，因此在细胞免疫应答中，调节基因的表达十分重要。在外界抗原刺激下，的复合物能够结合在的基因启动子的抗 巾农业大学博士学位论文第八草文献综述原反应识别原件（上，促进聚合酶与启动的结合，诱导调控基因的转录。同时复合物还能够出核与基闪转录形成的的’非编码区相结合，—广一？帽，攻广錄’導觀图梓指结构域的二聚体结构⑷绿色）和蔽色）结构域示意图，下面的双箭头是指丁结晶的蛋白质片段；（蛋白的侧视图和°旋转的顶视图；（如图巾使用相同的角度显示蓝色）灰色），参与二聚体的端和端的伸展部分黄色显不，端用品红色虚线显示缺失环。（从顶视的角度显不灰色）丁酵母聚合掠色）和添加酶（粉红色）° 中国农业大学博士学位论文第八章文献综述延长的寿命，增强基因的表达由此看出，复合物是基因表达的重要调控因子，为细胞免疫应答的调节提供了新的治疗祀点。复合物调节病毒的复制复合物除了参与以上正常细胞的生命活动，它还在多种病毒的复制周期中起着关键的作用。在复制过程中，蛋白（包括、、和参与了的复制过程。蛋白属于蛋白家族，它们能够结合基因组的’端和’端，从而促使病毒的环化，干扰细胞菜内的抑制的复制，表明蛋白在复制过程中起到正调控作用。。而在中，其’中的’可变区（’构成了蛋白的结合位点，参与了病毒的复制和翻译，并且对于终止密码子高效的翻译终止非常重要，表明’在病毒蛋白和合成的调节方面起着至关重要的作用而在小病毒中，通过’中的以帽子依赖性的方式启动病毒的翻译。首先将人鼻病毒型的替换脊髓灰质炎病毒的基因组中，构建重组病毒此病毒不能再神经细胞中翻译和复制，但不影响在胶质瘤细胞中的繁殖究其原因是即能够结合神经细胞中的而抑制病毒的翻译和繁殖⋯。排斥色谱法分析显示和能在神经细胞中形成二聚体，而在胶质瘤细胞中不形成二聚体，进行复合物只能结合神经细胞中的从而抑制病毒的起始翻译另有研究表明，参与了传染性法氏囊病毒的复制过程。激光共聚焦显示，主要聚集在细胞聚中的病毒复制位点，并与、和共定位。免疫共沉淀结果也证明了它们之间的相互作用。单独表达或共表达和并不能引起的胞奖聚集。利用技术下调的表达后发现细胞上清中的病毒含量提高了倍，表明与病毒蛋白相互作用抑制了传染性法氏囊病毒的复制。也参与了流感病毒的复制过程【】。通过免疫共沉淀结合质谱分析蹄选了与流感病毒的蛋白相互作用，然后利用和技术验证了两者具有相互作用，处理细胞裂解液并不影响二者的相互作用，说明它们之间的相互作用是非依赖性的，将用下调和细胞中的的表达，病毒的聚合酶活性和复制能力均得到了提高，表明与流感病毒的蛋白相互作用抑制了病毒的复制。复合物与的相互作用是依赖于的蛋白质激酶它能使真核细胞翻译起始因子发生磷酸化。和在细胞核和细胞质中都会形成复合物。在体外实验中，和都可以作为磷酸化的底物。通过个独立的机制与相互作用。一个是不依赖于的端（与的端（的相互作用，另一个是依赖于的的个结构域与的个结构域之间的相互作用。的端结构域能够抑制其端结构域被磷酸化。结合后，引起构象上的变化，增强了的活性。构象上的改变乂会导致其端 中农业大学博士学位论文第八章文献综述被隣酸化，与的作阳相同的娃，被磷酸化以后，改变了的构象，进一步提高了的活性，调节基因的转录。与的相互作用模观如图所、。图和相互作用模型蛋白质相互作用的主要研究方法细胞接受外源成足内源的信号，通过其特存的信兮途径，调节其基闪的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋内质很重耍的地位，它可以调控、介导细胞的许多生物〒：活性。然有一些蛋质可以以单体的形式发挥作用，但是人部分的蛋内质都是和伴侶分子一起作用或是与其他蛋质形成复合物来发挥作的。闪此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋内质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋质相互作的研究。在现代分子生物学中，蛋内质相互作用的研究有非常重耍的地位。研究蛋质相互作用的方法有酵母双交、哩歯体展示技术、免疫共沉淀、、劳光能共振转移技术（等。下面对两个主耍的技术进行综述。酵母双杂交技术酵母双交是一种言常经典的人规模筛选和验证两个蛋相互作的方法。酵母双染交技术有快速、步骤简单、能较其实反应细胞内蛋内的相互作用、能检测细胞内较微弱或瞬时的两蛋内相互作、同时还；！：有检测材料范围广和检测敏感？优点。酵母双染交系统的原理是利叫酵母的生闪产含冇两个结构域，一个是结合域（，以及另外一个结构域为转录激活域（将己知基闪即诱妈基因和祀基闪成含冇靴基闪的分别构建在含有和质粒载体上，将这两种质粒共同转化到酵母感受态细胞中，如果结合的诱馆蛋白能够与结合的祀蛋或者是文库中某些编 中国农业大学博士学位论文第八章文献综述码的蛋白相互作用，彼此间结合时，就会使位于侧翼的与在空间上接近，就能完全激活转录因子的活性，从而启动下游的报告基因，这样有相互作用的酵母就能在特定的缺陷培养基上生长利用此系统蹄选出很多具有相互作用的蛋白，譬如利用酵母双杂交技术发现和分别与和具有相互作用，这种相互作用有利于病毒的增殖‘。尽管此技术应用广泛，但仍有其局限性：酵母双杂交是分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究；酵母双杂交系统的一个重耍的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋扫质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生假性”结果。免疫共沉淀技术免疫共沉淀（，是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的或特异性地结合到免疫球蛋白的片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，赙育后再加入与抗体特异结合的结合于珠上的或，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“兴趣蛋白抗性蛋白抗体经变性聚两稀酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。此方法的优点是：相互作用的蛋内质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不止确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。展望近年来，非结构蛋白与宿主蛋白相互作用的研究取得了重要的研究进展，尤其是在和等方面，均蹄选了影响病毒复制的细胞蛋白，而在病毒结构蛋白研究中，主要还是病毒的囊膜蛋白与细胞受体之间的相互作用，，】，而结构蛋白与细胞内蛋白相互作用的研究相对较少，结构蛋白在病毒的复制、翻译方面同样发挥着重要的作用，然而其发挥生物学功能过程中还有哪些蛋白的参与？以及这些细胞蛋白在此过程中发挥什么作用？这些科学问题都需要进一步研究和解答。 中国农业大学博士学位论文参考文献参考文献，，，，，，，，杨汉春，管山红，尹晓敏，等猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定中国兽医杂志，’：郭宝淸，陈章水，刘文兴，等从疑似流产胎儿分离的研究中国畜禽传染病，：杨汉春猪高热综合征的发生与流行概况猪业科学，：，，，，，，，，，，，，，，， 中国农业大学博士学位论文参考文献，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，， 中农业人学博学位论文参义献，，，，，，，，，，，， 中国农业大学博士学位论文参考文献，，，，，，，，孙艳高致病性猪繁殖与呼吸综合征病责株单克隆抗体的制各及其抗原表位的鉴定：硕士学位论文北京：中国农业科学院，，王丽与宿主细胞蛋白和相互作用的分子机制：博士学位论文北京中国农业大学，，，，，，，，，， 中国农业大学博士学位论文参考文献，，，文雪霞，陈化兰，熊永忠，等抗原表位鉴定方法的研究进展中国畜牧兽医，，：，郭龙军，陆月华，黄立平，等猪圆环病毒型蛋核定位信号区抗原表位的鉴定中国农业科学，，：，，，，，，，，，，，，，，，， 中国农业大学博士学位论文参考文献，，，】，，，，，，，，丁，，，，，，，，，，，，，，，，， 中农业人学博学位论义参枣文献，，，，，，，’，，， 中国农业大学博士学位论文参考文献，，，，，，，，，，，，，，， 中国农业大学博士学位论文参考文献，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，】，，， 中国农业大学博士学位论文致谢致谢在本文付梓之际，首先向我的导师杨汉春教授表示崇高的敬意和衷心的感谢。感谢杨老师四年前将我收其门下，让我觉得成为他的学生已不再是我的梦想，那一刻的兴奋仍然记忆犹新；感谢杨老师每次在实验室例会上对我们的教诲，让我们学会了做事先做人、苛求完美的工作态度；感谢杨老师在我家最困难的时候对我们的支持，让我有更多的精力去兼顾家人和学业；感谢杨老师在我博士课题上的指引和论文的修改，让我感受到了导师严谨的科学态度和精益求精的工作作风。在此，对我的导师杨汉春教授表示深深的感谢和衷心的祝福！由衷地感谢哈尔滨兽医研究所的田志军研究员，本研究也是在田老师的悉心指导下完成的，每当我为课题愁眉不解时，田老师总是在身边像朋般地鼓励我支持我，让我冇一个愉快的科研氛围，使得我的课题得以顺利完成。感谢给予我帮助、支持和关心的所有老师和同学！特别感谢多年来默默无闻为我付出的父母及家人，没有你们的支持就没有我的今天。 中国农业大学博士学位论文作者简历作者简历个人简介：王倩，女，汉族，中共党员，年月出生于黑龙江省哈尔滨市；年月至年月，黑龙江省哈尔滨市第中学；年月至年月，东北农业大学动物医学学院，动物医学（本硕连读）专业，获农学硕士学位；年月至年月，中国农业大学动物医学院，预防兽医学专业，攻读博士学位；年月至年月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，客座研究生，从事动物分子病毒学与免疫学研究。在读期间发表的科研论文：，，，，’，，，，，，，，