gfp标记内生枯草芽孢杆菌y10及其在白菜体内的定殖

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生态学杂志ChineseJournalofEcology2015，34(7):2064－2070GFP标记内生枯草芽孢杆菌Y10*及其在白菜体内的定殖112，3112，3＊＊杜芳何鹏飞吴毅歆陈卓君杨静何月秋123(云南农业大学植物保护学院，昆明650201;微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心，昆明650207;云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201)摘要枯草芽孢杆菌Y10是具有防治根肿病的白菜内生菌株。为研究其在白菜体内的定殖规律，将不同来源的含绿色荧光蛋白(GFP)质粒导入Y10进行荧光标记，测定了荧光标记菌的质粒稳定性、生长曲线及室内平板拮抗活性。结果表明，仅有pHT01-P43GFPmut3a能在Y10中稳定地遗传，且对Y10的生长和病原真菌拮抗活性无不利影响。盆栽防效试验结果显示，在不同的栽培基质中，Y10的标记菌株与野生型对白菜根肿病防效无显著差异。稀释涂板回收及共聚焦激光扫描显微观察都证实，接种9d后在白菜的根、34－1茎及叶部组织均有标记菌株的定殖，且在44d内仍保持10～10cfu·g组织。这些定殖结果表明，Y10在白菜体内具有良好的定殖能力，且这种特性可能与其防治根肿病有关。关键词内生枯草芽孢杆菌;绿色荧光蛋白;防治效果;质粒;遗传转化中图分类号S476．1文献标识码A文章编号1000－4890(2015)7－2064－071ColonizationofGFP-taggedendophyticBacillussubtilisY10inChinesecabbage．DUFang，12，3112，3＊＊1HEPeng-fei，WUYi-xi，CHENZhuo-jun，YANGJing，HEYue-qiu(FacultyofPlant2Protection，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China;NationalandLocalJointEngineeringResearchCenterforScreeningandApplicationofMicrobialStrains，Kunming650207，3China;FacultyofAgronomyandBiotechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)．ChineseJournalofEcology，2015，34(7):2064－2070．Abstract:EndophyticBacillussubtilisY10isolatedfromChinesecabbage(Brassicarapa)cancontroleffectivelycruciferousvegetableclubrootdisease．Tounderstanditsclubroot-controlmechanisms，GFPplasmidsweretransformedintoY10cellsforfluorescence-taggingbynaturaltransformation．Theplasmidstability，growthcurveandplateantagonismbio-assayofGFP-taggedstrainsweredetermined，andtheresultsshowedonlyplasmidpHT01-P43GFPmut3acouldbemaintainedstablyanditsintroductionhadnosignificantnegativeinfluenceonY10growthandantagonisticperformance．Potbio-assayexperimentwithdifferentcultivationmatrixesindicatedthattherewasnosignificantdifferenceinclubroot-controlefficiencybetweenY10-P43GFPmut3aanditswildtype．Recoveryandobservationbyconfocallaserscanningmicroscopeconfirmedthat，9daysafterinoculation，taggedstraincouldcolonizetheroot，stemandleafofChinese34－1cabbage，andthecolonizationdensitystillkeptat10－10cfu·gtissuesin44daysafterinoc-ulation．Alltheresultssuggestthattheclubroot-controlofY10beintimatelyassociatedwitheffi-cientcolonizationinChinesecabbagehost．Keywords:endophyticBacillussubtilis;greenfluorescentprotein(GFP);controleffect;plas-mid;genetictransformation．DOI:10.13292/j.1000-4890.20150615.008植物内生细菌是一类生活于植物组织内，一般认为对寄主植物的生长发育无持续性或明显伤害的细菌(Sicilianoetal．，2001)，是农业有益微生物的*农业部公益性行业(农业)专项(201003029)资助。重要来源之一。十字花科根肿病是一种土传真菌病＊＊通讯作者E-mail:ynfh2007@163．com害，由于该病传染力强，传播途径多，危害损失大，防收稿日期:2014-12-12接受日期:2015-04-09 杜芳等:GFP标记内生枯草芽孢杆菌Y10及其在白菜体内的定殖2065治困难，被称为十字花科作物的“癌症”，属国内植抗生素种类及其最终浓度:氨苄青霉素物检疫对象。目前，国内外已有一些学者从不同的(Amp)、卡那霉素(Kan)以及氯霉素(Cm)的使用浓－1场所或植物组织内分离出微生物用于根肿病的防度分别为100、25和10μg·mL。治。如Hashiba等(2005)从大白菜根部分离的暗色白菜品种:鲁春白1号，青岛国际种苗业有限公有隔内生真菌Heteroconiumchaetospira，可减少自然司生产。土中根肿病的发生;王婧等(2011)从白菜根际土壤1.2试验方法及红豆树根分离的链霉菌(Streptomycessp．)A3161.2.1Y10菌株的自然转化Y10的自然转化具和A10，其培养液可抑制根肿病菌休眠孢子的萌发，体操作细节参考枯草芽孢杆菌普通转化方法(李瑞室内盆栽及大田试验对根肿病也有较高的防效;何芳等，2011)。在光电折射仪(蓝盾621)下观察抗月秋等(2008)从大白菜根际土壤中成功分离到一性LB平板上的菌落荧光表现，挑取荧光较强的转株枯草芽孢杆菌XF-1(保藏号为CGMCCNo．化子，并根据导入质粒的不同分别命名为Y10-pHA-2357)，室内及田间对根肿病防效分别可达85．0%PII、Y10-pGFP4412和Y10-P43GFPmut3a。及68．6%～84．8%。但是这些报道多数是关于对根1.2.2不同GFP标记菌株的稳定性测定过夜活肿病菌拮抗微生物资源的分离筛选及应用，对于其化荧光标记菌株，以0．1%(v/v)比例接种于不含抗－1具体的生防机制研究报道较少。多数防病机制被认生素的液体LB培养基中，37℃，160r·min培养5为与微生物自身的次级代谢产物如抗生素(Lieth;按相同比例转接入无抗生素的液体LB中，相同al．，2013)和几丁质酶(Jinetal．，2006)拮抗病原条件下培养;如此转接10次，每次转接前，取样后菌，诱导植物抗性(Lahlalietal．，2013)及提供营养10倍梯度稀释并均匀涂布于无抗生素的LB平板元素(如氮)(Usukietal．，2007)等相关，但在寄主上，37℃下培养过夜;统计平板上长出的菌落总数植物上的定殖行为及规律的研究相对偏少。以及发出绿色荧光的菌落数，计算荧光工程菌占总绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)菌落的百分比，检测工程菌在非选择压力下的稳定因其具有无需外源反应底物、操作简单、荧光稳定、性(钟晓东，1998)。检测方便、无细胞毒性以及可原位实时动态观察等1.2.3不同GFP标记菌株与野生型菌株的生长速特点，已经成为应用最为广泛的一种标记。枯草芽率野生菌株Y10和上述的3种标记菌株，分别划孢杆菌(Bacillussubtilis)Y10(下称Y10)是本实验线于LB和含相应抗生素的LB平板上，37℃培养室从白菜种子中分离出的一株对白菜根肿病具有较15h;待其长出单菌落后，挑取单菌落接入含或不含好防效的内生菌。为了明确其防病机制，笔者采用相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，160r·－1GFP标记了Y10，初步探究了标记菌在白菜体内及min过夜培养;用新鲜无菌液体LB将其浓度统一根围土壤中的定殖规律。调整至OD600为1．0，按1/100的接种比例转接到新－1鲜无菌液体LB中;37℃，160r·min振荡培养，在1材料与方法转接培养的前6h，每隔1h测定其溶液OD600一次，1.1试验材料第8～20h，每隔2h测定1次;第22～60h，每隔4菌株和质粒:内生枯草芽孢杆菌(Bacillussubti-h测定1次。此试验中的每个处理重复3次。以取lis)Y10、大肠杆菌(Escherichiacoli)TG1以及引起三样时间为横轴，以菌液OD600数值为纵轴，绘制出4七根腐的茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)为本实验室种菌株的生长曲线。保存;携带氨苄青霉素和卡那霉素抗性标记的大肠1.2.4不同GFP标记菌株与野生型菌株的室内拮杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHAPII(Caoetal，2011)和抗活性观察以茄腐镰刀菌为指示病原真菌，采用pGFP4412分别由南京农业大学沈其荣教授和中国平板对峙法观察标记菌株和野生型菌株对该菌的室农业大学王琦教授惠赠，携带氨苄青霉素和氯霉素内拮抗活性。用无菌接种针从保存有病原真菌的斜双重抗性标记的pHT01-P43GFPmut3a则由本实验面试管中挑取一小块菌丝接种于PDA平板中央，28室自行构建。℃下培养2～3d;用打孔器(0．5cm)在菌落的边缘培养基:LB固体及液体培养基，PDA固体培养打取菌饼，将其置于新鲜无菌的PDA平板中央，并基，枯草芽孢杆菌自然转化培养基GMI、GMII。用无菌牙签蘸取标记菌株和野生型菌株的单菌落， 2066生态学杂志第34卷第7期分别点菌于距菌饼3．0cm处。28℃下培养5～7聚激光扫描显微镜下观察。观察时使用的激发波长d，观察抑菌圈的有无及大小。以不接标记菌和野生为480nm，收集波长为510nm，利用软件收集分析菌株的病原真菌培养平板为空白对照，设重复4次。图像。茎、叶等组织部位的荧光观察，除了无需用无1.2.5标记菌株与野生型菌株对白菜根肿病的盆菌水洗涤外，其余细节与根系处理类似。栽防效试验选取不含根肿菌的土壤作为自然土、2结果与分析灭菌2次的自然土、有机质以及灭菌2次的有机质等4种白菜生长的栽培基质。按20份土样加1份2.13种不同GFP质粒标记Y10的荧光表现根肿病根充分混匀，装入上口直径80．0cm、下口直将含有GFP基因的3种不同质粒分别导入Y10径75．0cm、高20．0cm的盆中;每盆播入15粒白菜的自然感受态细胞中，它们在相应的抗性LB平板上种子，出苗后每盆定苗10株。每种栽培基质设3个均可形成绿色荧光的抗性菌落。其中携带pHT01-处理:标记菌株Y10-P43GFPmut3a，野生菌株Y10以P43GFPmut3a的Y10(即Y10-P43GFPmut3a)在紫外及空白LB对照，每处理3盆重复。余下的浇灌接光激发下发出的荧光亮度明显弱于Y10-pHAPII和菌、病情调查及计算等参考王会军等(2014)提出的Y10-pGFP4412菌株，后两者长时间放置后，在自然方法。可见光下其菌落就会呈现淡黄色。用荧光显微镜检1.2.6标记菌株在白菜体内及根际土的定殖回收测上述转化子也得到类似的结果(图1)。及观察供试白菜播种在盛有自然土的盆中，待白2.2不同GFP标记菌株的质粒稳定性菜长出4片真叶时，每盆灌入一定体积的标记菌株通过连续稀释转接培养，荧光质粒随着转接次7－1悬液，保证菌体的最终含量为10cfu·g土。在浇数的增加，培养时间的延长，质粒不断地从Y10菌灌白菜的第3、5、7、14、24、34以及44d分别取样，体细胞中丢失，荧光蛋白标记菌在总菌落群体中数回收检测标记菌在白菜的根际、根表、根、茎以及叶量比例不断下降;纵向比较来看，Y10-P43GFPmut3a的定殖数量。具体试验细节参见文献(何鹏飞，的质粒稳定性最高，无选择压力条件下转接培养502014)。h后的稳定性仍可达80．21%，Y10-pHAPII为在浇灌接菌后的第3、5和9d分别取样观察标42.28%，Y10-pGFP4412的稳定性最差，至30h，已记菌在白菜根、茎及叶组织部位的定殖情况。取样经看不到荧光标记菌的存在(图2)。芽孢杆菌在实时，将白菜幼苗从土壤中轻轻拔出，用自来水轻柔持验室营养丰富的条件下大约20～30min分裂1代，续冲洗附着于根表的土壤颗粒及杂物等，直至所有而在自然条件下繁殖1代所需的时间为50～100h肉眼可见异物全部冲洗干净，无菌水漂洗2～3次后(Heckeretal．，1990)。据此推算，标记菌Y10-再用吸水纸吸干根系表面的残留水分。随后用干净P43GFPmut3a适合于在生育期较长的作物上定殖研的刀片将白菜的根系切成5mm小段，将其置于载究，而Y10-pHAPII及Y10-pGFP4412则只适合短期玻片上，加无菌甘油1滴，盖上盖玻片，在Leica共的定殖研究。图1携带不同GFP质粒的Y10菌株在荧光显微镜下的荧光表现(×400)Fig．1FluorescenceofY10strainstaggedwithdifferentGFPplasmidsunderthefluorescencemicroscope(×400) 杜芳等:GFP标记内生枯草芽孢杆菌Y10及其在白菜体内的定殖2067图2Y10GFP标记菌株的稳定性检测Fig．2StabilitydetectionoftheY10GFP-taggedstrains图3Y10GFP标记菌株及野生型菌株的生长曲线Fig．3GrowthcurveofY10GFP-taggedstrainsandwildtype2.3Y10的GFP标记菌与野生型生长速率的测定Y10标记菌株与野生型在无选择压力的液体Y10-P43GFPmut3a及野生型对白菜根肿病都表现出LB培养基中的生长曲线如图3所示。在整个测定较好的防治效果(表1)，且两者的防效没有明显的过程中，Y10-pHAPII和Y10-pGFP4412的生长都要差异;此外，菌株对白菜根肿病的防效不受白菜生长滞后于野生型，这种滞后现象在菌体细胞进入平台所使用的栽培基质的影响，说明质粒pHT01-期后表现得更为明显，表明GFP的大量表达给宿主P43GFPmut3a的引入并未对菌体体内的能量代谢造菌的能量代谢带来了负担;Y10-P43GFPmut3a的生成过重的负担，亦未影响到其生防表现。另外，在4种不同栽培基质处理中，标记菌株和野生型菌株的长变化趋势与野生型菌株相同，虽然其OD600略低于防效都稳定在60%～70%，这暗示Y10对不同的白野生型。菜栽培基质具有良好的适应性。2.4Y10GFP标记菌株与野生型菌株的室内拮抗2.6标记菌株在白菜不同组织中的定殖活性测定如图5所示，在浇灌接菌的第3天，在白菜幼苗实验室试验已证实，Y10菌株对多种常见的植的根部、根际土及根表土能检测到标记菌株，数量分物病原真菌都表现出较强的拮抗活性。从图4可以455－1别在10、10和10cfu·g。接菌后的第5天能在看出，3种GFP标记的Y10菌株对茄腐镰刀菌的拮白菜幼苗的茎、叶组织中回收到标记菌。在调查取抗能力与野生型无明显差异，即GFP标记的插入没样期间，标记菌在白菜根际土和根表土壤内的菌落有影响Y10菌株抑制该真菌的活性。密度呈现出先升后降，最后趋于稳定的趋势(图5)。2.5标记菌株与野生菌株对白菜根肿病的盆栽另外，虽然变化趋势相同，但是根表土壤中的菌落数防效量始终略高于根际土壤。标记菌株在白菜根内的定在白菜的盆栽实验中，Y10的GFP标记菌株殖表现出先升后降，在调查的后期(34d)定殖数量图4Y10GFP标记菌与野生型菌株对茄腐镰刀菌的室内拮抗比较Fig．4ComparisonoftheinvitroantagonismagainstFusariumsolanibyY10GFP-taggedstrainanditswildtypeA．处理组;B．空白对照。 2068生态学杂志第34卷第7期表1标记菌株与野生型菌对白菜根肿病的防治效果Table1ControleffectofY10GFP-taggedstrainandwildtypeonclubrootdisease项目自然土灭菌土有机质灭菌有机质CKABCKABCKABCKAB病情指数57．8523．5722．1456．4616．6718．0153．5718．7920．2750．3817．3918．29防治效果(%)－5962－6764－6562－6968CK为浇灌无菌液体LB处理组;A为浇灌Y10野生型菌株处理组;B为浇灌标记菌Y10-P43GFPmut3a处理组。的种子和植株体内分离出多个具有生防潜力的芽孢菌株。Y10是从白菜种子中分离的内生枯草芽孢杆菌，在离体条件下，Y10可以通过自身的代谢分泌物裂解根肿病菌的休眠孢子(王会军等，2014)。不同来源的GFP质粒标记的Y10菌株，荧光强度有所差异。这可能与质粒的拷贝数有关:pHAPII－1和pGFP4412都是以高拷贝(50～100个·细胞)图5标记菌株Y10-P43GFPmut3a在白菜体内的定殖的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)内生质粒Fig．5ColonizationofY10-P43GFPmut3aonChinesecab-pUB110为基本骨架构建而成，而pHT01-bage－1P43GFPmut3a则是由低拷贝(5～10个·细胞)的有所上升后又下降(44d)，与前人的报道相一致，但芽孢杆菌内生质粒pBS72构建而来(Titoketal，与初期在根部定殖的菌量相比，有所增加，且浓度维2003，2006)。质粒稳定性试验发现此3种质粒在宿持在104cfu·g－1根组织;茎组织内标记菌株数量呈主菌体内的稳定性不同，这可能与质粒的复制方式先升后降，最后又上升的变化趋势，数量基本在104有关联:像pE194、pC194和pUB110等以滚环方式－1进行自我复制的小质粒，在复制时会形成大量积极cfu·g组织;在叶部组织中标记菌呈先上升(3～7d)，中间稳定(14～24d)，后期上升后又下降(24～参与质粒内部序列重排的由单链DNA和高分子量34－1多聚物组成的中间体，导致质粒结构不稳定(Gruss，44d)，数量维持在10～10cfu·g组织。总体来看，标记菌株在白菜体内的定殖数量表现出根＞茎＞1989))。与野生型菌株相比，标记菌株的生长速率叶。与初期(3d)的定殖数量相比，调查取样的末期也不尽相同，这可能与质粒的拷贝数、复制方式以及(44d)每个定殖场所或部位内标记菌的数量都有所分子量的大小都有关系。本研究中，被认为是最稳增加或维持平衡，这表明Y10菌株与白菜有良性的定的GFP质粒pHT01-P43GFPmut3a，其遗传稳定性互作关系，对白菜的生长环境也有较强的适应性。也明显低于前人(范晓静等，2007)的报道，这可能2.7标记菌株在白菜体内的定殖显微观察是由于芽孢杆菌的培养温度、转速及菌株特性等有共聚焦激光扫描显微镜观察标记菌株在白菜体所差异。内的定殖，结果发现，在接种后的第3天，就可以观除了分泌次生代谢产物直接杀死病原物、诱导察到标记菌在白菜根部的定殖，优先定殖于根毛、根抗病性、提供矿质营养等，在寄主作物上快速有效且尖和分生区，定殖的同时还伴随有致密的生物膜形稳定的定殖也是生防细菌发挥生防促生的一个重要成(图6D、E和F);第5天，在茎组织的切片中发现机制。根肿病菌侵入最佳方式是通过白菜种子萌发标记菌的踪迹(图6G)，这与能在茎组织中回收到形成的根毛入侵。在本试验中回收检测标记菌标记菌株的结果相吻合;第9天，在叶片组织可以观Y10-P43GFPmut3a时，其能在较短的时间内实现在察到标记菌株的存在(图6H)。根(第3天)、茎(第5天)及叶(第5天)的定殖(图5)，暗示与根肿病菌共同竞争生态位点时并没有处3讨论于不利地位;同时还发现标记菌能长时间地定殖于十字花科作物根肿病是一种严重的土传病害，白菜的根、茎和叶以及根际土壤，并且在不同部位的极难防治和根除。从寄主植物中分离内生细菌可能定殖所表现出趋势以及定殖数量各有不同:根表土是一种快速获得生防资源的合理手段。通过前期的中的菌落密度始终高于根际土，这可能与根系分泌工作，本实验室从白菜、萝卜、甘蓝等十字花科作物物的渗透扩散有关;定殖于根部的菌体数量也高于 杜芳等:GFP标记内生枯草芽孢杆菌Y10及其在白菜体内的定殖2069图6GFP标记菌Y10-P43GFPmut3a在白菜根、茎及叶组织的定殖Fig．6ColonizationofY10-P43GFPmut3aincabbageroot，stemandleaftissuesA．根对照;B．茎对照;C．叶对照;D．根毛;E．根尖;F．伸长区根;G．茎(第5天);H．叶(第9天);箭头表示Y10-P43GFPmut3a形成的生物膜。茎、叶组织，可能是由于根部含有较多适合的蛋白质过程中，标记菌在白菜的根表形成生物膜，这进一步和糖分等营养物质，这间接证明Y10可在白菜根际证实了Y10可以在白菜根系稳定地定殖，表明其具土壤及根部定殖，通过占据生态位点，改善根部土壤有作为根系接种剂防治白菜根肿病的应用潜力。回微环境，阻止根肿病菌的侵入，达到防治根肿病的收及切片观察的结果发现Y10除了在白菜根部定效果。殖外，还可以在其茎、叶部组织中存活增殖，这表明与Zhang等(2011)报道的结果相似，共聚焦扫Y10在白菜体内具有良好的运输传导性能，由于其描显微切片观察发现标记菌株优先定殖于白菜的根促生长效果明显，故具有开发成微生物叶面肥料的毛、根尖以及伸长区等部位，这可能与这些区域内的潜力。细胞间隙较大及细胞代谢活动较为旺盛有关。生物参考文献膜所包被的细菌群体(Costertonetal．，1995)，对多范晓静，邱思鑫，吴小平，等．2007．绿色荧光蛋白基因标种不良环境有较强的耐受力。切片观察发现在定殖 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