基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备

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第31卷第5期华中农业大学学报Vo1．31No．52012年1O月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityOct．2012。598～603基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备秦绍钊何月秋李曼雷屈文王光勇。丁元明1．云南农业大学植物保护学院，昆明650201；2．云南出入境检验检疫局技术q-心，昆明650228；3．昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明650224摘要基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)#b壳蛋白抗原表位所在的结构域，明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319~328、384~388、420~430、480~487、495~511位氨基酸残基附近。通过RT-PCR扩增出了目的片段，构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体，表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性。采用杂交瘤细胞技术，利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体，制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应。检验结果表明，制备的抗血清具较好的特异性，可应用于TRSV的检疫检验。关键词烟草环斑病毒；抗原表位；原核表达；融合蛋白；单克隆抗体中图分类号S41；S432．41文献标识码A文章编号1000—2421(2012)05—0598—06烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus，顺利开展。国内有关TRSV抗血清制备的报道中，TRSV)隶属豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，是线制备的血清为多克隆抗体L1。j或只是原核表达载体虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种。该病毒的构建[1，尚未见TRSV单克隆抗体制备的研究与粒子是球状、等轴、直径约28nm的二十面体，壳粒报道。由于多抗血清的特异性和效价都存在一定的由60个外壳蛋白亚基组成。TRSV的自然寄主范局限，所以无法保障检测结果的准确性。围广，可侵染54科246种植物[1]。TRSV传播途径笔者根据综合预测结果，有针对性地扩增烟草多样，可通过种子传播、嫁接、机械接种、媒介传播。环斑病毒壳蛋白抗原表位基因所在结构域，获取了TRSV分布于世界50多个国家，我国已从荷兰进口其外壳蛋白的外源融合蛋白，并通过杂交瘤细胞技的萝卜种子、美国进口的大豆和塞尔维亚进口的葵术制备特异性强、灵敏度高的TRSV单克隆抗体，花种子等进口货物中截获了烟草花叶病毒，并将其旨在为准确、快速检疫烟草花叶病毒提供科学依据。列人中国进境检疫性有害生物名录l2]。为防止其1材料与方法通过进出口贸易传人我国，需要加大检验检疫力度。近年来，国内关于烟草环斑病毒的研究报道较1．1供试材料多，但主要集中在生物学的研究和检测方法的建立。烟草环斑病毒(TRSV)从来自云南的文殊兰上早期的研究工作多在病毒的复制与转录、病毒粒体分离得到；E．coliDH5a、TOP10菌种；BALB／c小细胞问传播过程和电化学酶联免疫分析等方面l_3]。鼠，SP2／0骨髓瘤细胞等供试细胞均由云南出入境分子检测的研究主要体现在建立各种不同的方法。检验检疫局技术中心提供。杨翠云等_7]建立了RT-PCR和IC-RT-PCR检测克隆载体pMD18一T购自TaKaRa公司；原核方法。易汪雪等_gJ建立了单管实时荧光RT_PCR表达试剂盒pBAD／TOPO~ThioFusionTMExpres—方法。常规的RT-PCR方法检测也有相关的报sionKit购自Invitrogen公司。道[1012]。以上检测方法虽能提高检验检疫工作效1I2生物信息学软件分析率，但是在检测过程中因检测样品较多，需要使用大首先，利用软件ClustalX(1．83)、MEGA5．0量的抗血清，其中大部分是价格昂贵的进口血清，加和BioEdit7．0对TRSV所有分离物核苷酸序列和之进口血清到货时间周期长，故不便于检测工作的氨基酸序列进行多序列比对(multiplesequence收稿Et期：20120416基金项目：国家质检总局科技计划项目(2010IK259)秦绍钊．博士研究生．研究方向：植物病毒学．E-mail：szqin@163．corn—通讯作者：丁元明，硕士，研究员．研究方向：植物病毒病害及检验检疫．E-mail：dingdym2008@yahoo．corn．cn 第5期秦绍钊等：基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备599alignment)分析各自的保守区域。其次，通过蛋白DNA0．5L；T4DNALigase1L；加ddH20至质结构预测结果最可靠的同源模型化的方法，分析终体积；置于4℃过夜。TRSV外壳蛋白有3个主要结构域，显示外壳蛋白用Nco工和EcoRV进行双酶切鉴定。酶切体系模拟结构中暴露在表面的位点。第三，采用不同的(100L)：10×Buffer2OI．，；Nco工2L；EcoRV计算方法和软件分析TRSV外壳蛋白的抗原表位、2L；pBAD／TOP-CP10L；ddH2O66L；混匀后氨基酸弹性、表面可及性分析、抗原指数、片层和置于37℃过夜。酶切产物用1．5的琼脂糖凝胶电卷曲结构、a螺旋和B转角。第四，根据以上3个方泳进行分析。将经酶切鉴定：勾阳性的克隆进行序列面的研究结果，确定TRSV外壳蛋白抗原表位在不测定。将鉴定正确的重组子(命名为pBAD／TOP-同结构域中所在的区域。nV_CP)送上海生工生物技术公司进行序列测定。1．3RNA提取和引物设计1．6外源蛋白的表达、纯化及鉴定采用Invitrogen公司的Trizol方法提取病毒总将上述测序后正确的菌落在平板LB(Amp，RNA。溶解在3OLDEPC处理的水中，一7O℃下100／~g／mL)上划线，将单菌落接种于3mL液体保存。根据GenBank中已报道的TRSCP基因LB(Amp，100>g／mL)中，37℃下120r／min振荡序列(登录号：AF461163，AF461164，AY363727，培养至D。。一1～2。将3OL菌液分别加入已准备AY787756，L09205，NC005096)保守区，结合抗原的含有3mL液体LB(Amp，100,ag／mL)的5个冻表位预测的结果，设计了特异性引物。引物由上海存管中，37℃下120r／min振荡培养至D∞=1～2。生工生物技术有限公司合成。F—primerTRSV-上述3mL的正处于对数生长期中期的培养物，以CP1：5'-ATGGGGCCCGTCATTGATCGT一3(1～不同终质量分数为0．2、0．02、0．002、21)；R-primerTRSV-CP1：5'-GAACAAAGTG—0．0002的阿拉伯糖溶液进行诱导，37℃下120GCGGAGCGACC一3(1044~1024)。r／min振荡培养4h。1．4RT．PCR目的片段的扩增按Invitrogen公司的ProBondTMPurificationcDNA第一链的合成，反应体系为20肚L，在System说明书中纯化多聚组胺酸融合蛋白的步骤0．5mLPCR反应管中，先加入总RNA5肚L，Ra—以Ni抖一NTA方法从表达培养菌液中纯化重组蛋domprimer(10pmol／gL)1uL，AMV(10U／~L)白，表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳参照朱常香1L，5XBuffer5L，dNTP(2．5mmol／L)2L，等_13_的方法进行。RNaseInhibitor(40U／IxL)1L，DEPC处理水1．7表达产物Westernblot的鉴定5L。反应条件：25℃10min，42℃90rain，采用Invitrogen公司的ProBondTM多聚组胺酸95℃5rain，4℃5rain。融合蛋白纯化试剂盒的抗V5的抗体(结合辣根过PCR反应体系为2OL：ddH2O4L；dNTP氧化物酶标记，即Anti—V5一HRP)作为与靶蛋白结(2．5mmol／L)2L；10×LATaqBuffer5L；合的特异抗体进行Westernblot分析。Upprimer(10pmol／／~L)2“L；Downprimer(101．8间接ELISA方法的建立pmol／／~L)2L；cDNA3L；LATaqpolymerase第3次免疫7d后，每只小鼠断尾采血100gL，(1U／／~L)2uL。在选择抗原的最佳包被浓度、最佳包被条件和抗体PCR反应条件：预变性95℃5min；变性最佳工作浓度、最佳反应时间等条件的基础上，建立94℃50S，退火58℃60S，延伸72℃90S，30个间接ELISA方法。用该方法检测小鼠免疫后的抗循环；72℃10min；16℃保存。体水平以及筛选阳性细胞孔。取PCR产物5／xL，Marker为DL2000，1．51)包被。用包被液分别按1：100、1：200、琼脂糖凝胶电泳，观察所扩增片段的大小。采用1：400、1：800、1：1600稀释抗原为最佳包被浓TaKaRa公司的DNA凝胶回收试剂盒纯化DNA。度，然后分别加到酶标板中，每孔加100L，在最佳1．5原核表达载体的构建包被条件下进行包被。将PCR产物回收纯化后，按载体操作手册进行2)洗板。弃去包被液拍干后，每孔加洗涤液连接，连接反应体系组成：PCR回收纯化产物4．5200L，4rain后弃洗涤液如此重复3次。L(5O～250ng)；10×LigaseBuffer1L；载体3)封闭。每：MJU封闭液200L，37℃孵育1h， 600华中农业大学学报第31卷弃封闭液。洗涤同上。4)加一抗。将抗体稀释到最佳浓度，加到酶标板中，每孔加100j上L，37℃温箱分别孵育30、6O、90、120rain，筛选最佳反应时间。5)洗板。同上。6)加酶标二抗。将抗体按1：5000稀释到最佳浓度，每孔i00L，37℃温箱分别孵育3O、60、90、120rain，筛选最佳反应时间。7)洗板。同上。8)显色。加底物液，每孔100L，37℃避光放置10rain。M．分子质量标准；2，3．目的基因PCR扩增产物；1．阴9)终止。加终止液终止显色反应，每孔50L，性对照(H20)。M．Marker；2，3．PCRproductsamplified；用酶标仪测定Ds。值。1．Negativecontro[(H20)．10)结果判定。以P／N≥2．1且P／N值最大时图1TRSVCP基因的RT-PCR产物电泳图所对应的反应时间为最佳反应时间。Fig．1EleCtrODhOreticprofileof1．9单克隆抗体的制备TRSV0PRT-PORproduct病毒提2纯参l照明艳林等_1Ilj的方法进行。通过2．3表达载体的酶切与测序4次免疫5O∞只6周0∞龄O"的OBALB／Oc小0m鼠，采用杂交瘤用质粒提取试剂盒提取pBAD-TRSV-CP重组细胞技术制备单克隆抗体l1。表达质粒，用Nco工和EcoRV对表达重组质粒进1．1O单克隆抗体的纯化和鉴定行双酶切，1．5琼脂糖凝胶电泳鉴定，CP基因正向单克隆抗体的纯化采用辛酸一饱和硫酸铵法进插入的质粒产生约3．6、1．1、0．6kb的3条片段，行[1618]。采用间接EIISA方法检测TRSV单克隆均与预期的目的条带大小基本一致(图2)。将鉴定抗体与LoMV、ArMV、I．SV、SIRSV的交叉反应正确的重组子(命名为pBAD-TRSV_CP)送上海生性。用Biotech公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试工生物技术公司进行测定，测序结果与预期的一致。剂盒鉴定单抗的抗体亚类。2结果与分析2．1TRSV—CP抗原表位预测结果利用软件综合分析，预测TRSV外壳蛋白抗原表位区可能位于C端319～328、384～388、420～430、480~487、495～5】1位氨基酸残基附近。2．2TRSV．CP基因的扩增与克隆^，L分子质量标准；1．阴性对照(H20)；2，3．CP摹因正用设计的CP基因特异性引物进行RT_PCR扩向插入。M．Marker；】．Negativecontrol(H2())；2，3．InsertCPgenerecombinationplasmid．增，扩增产物经1．59／6的琼脂糖凝胶电泳分析，显示扩增片段大小约1044bp，与预期结果相符(图1)。图2重组质粒pBAD．TRSV．CP的酶切鉴定PCR‘增产物经回收、连接、转化克隆到pMD-18TFig．2TheidentificationoftherecombinationplasmidpBAD·-TRSV--OP载体上进行双酶切，经1．5琼脂糖凝胶电泳鉴定，将经酶切鉴定为阳性的克隆进行序列测定。将鉴定2．4表达产物的纯化与鉴定正确的重组子(命名为pMD-18T-TRSV-CP)送上SDPAGE分析结果表明，经阿拉伯糖诱导表海生T生物技术公司测序。测序结果表明，本试验达，可产生约54．7ku的特异蛋白条带，且以终质量所扩增的序列与GenBank中已报道的TRSV-CP分数为0．029／5的阿拉伯糖诱导表达4．5h后的表达基因序列同源性达到94～99。确认所挑选的量最高(图3)。经诱导的阳性对照菌和未经诱导菌菌落为含有插入目的片段的重组子。株的菌液中未见相应的条带，据此可初步确定重组 第5期秦绍钊等：基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备601表达质粒pBAD／TOP-TRSV-CP中外壳蛋白基因97．2得到表达。66．4诱导培养后收获的菌体经高压破碎仪破碎，离443≮心取上清液为粗提物，经SDS-PAGE分析，沉淀中29．0无目的蛋白，说明已经完全获得了目的蛋白。粗提．的重组蛋白质经Ni～NTA纯化和SDS-PAGE电f43女嚣器_泳分析，结果只有1条分子质量为54．7ku的蛋白质条带(图4)。图4中的泳道3与4作为菌液纯化M．蛋白分子质量标准；1．阴性表达对照(未诱导菌株)；2．终质量分数为0．02的阿拉伯糖诱导表达结果；前后的对比，证实重组核蛋白得到了很好纯化。3．纯化后菌液；4．纯化前菌液；5～8．蛋白纯化结果。将pBAD-TRSV-CP重组载体表达的重组CPM．Proteinmarker~1．Negativecontrol(non-induced)；蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素滤膜2．pBAD-TRSV-CPinducedexpressionbyat0．2L-arabi—上，加入His标签标记的鼠抗抗体完成免疫学反应，nose；3．PurifiedliquidofTRSV-(；4．Non-purifiedliquidof显色后出现与重组融合蛋白分子质量相应大小的条TRSV-CP；5-8．PurifiedTRSv_CPprotein．带(图5)，说明所表达的TRSV-CP蛋白具有良好的图4纯化后TRSV-CP蛋白的SDS-PAGE分析免疫学活性。Fig．4SDS—PAGEanalysisofpurifiedproteinfrOmpBAD—TRSV．CPinducedexpressioninTOP10k¨M972确u藏Ejt66．4??|。j姐擎。l秀。443蛳睡201獭黼M蛋白分子质量标准；1．阳性对照；2．阴性对照(未诱导菌株)；3～6．终质量分数分别为0．2、0．02、143黼0．002、0．0002的阿拉伯糖在TOP10中的诱导表达。M．Proteinmarker；1．Positivecontrol；2．Negativecontrol^，L蛋白分子质量标准；1，2．诱导表达产物的免疫印迹(non-induced)：3-6．pBAD-TRs、■CPinducedexpressionin分析。M．Proteinmarker；i，2．AnalysisoftheexpressedTOP10byL-arabinoseat0．2，0．02，0．002，0．0002productbyWesternblot．respectively．图5诱导表达产物的Westernblot分析Fig．5AnalysisoftheexpressedproductbyWesternblot图3重组质粒pBAD—TRSV-CP在TOPl0诱导表达产物的SDS．PAGE分析佳孵育时间为60min。Fig．3SDS—PAGEanalysisofthepBAD—TRSV-OP2．6单克隆抗体的纯化与鉴定expressionproductinE．coliTOPIO由于胎生牛血清中支原体的污染，试验最终只2．5间接ELISA方法的建立获得1株杂交瘤细胞株(61-)2)，其单抗亚型测定结根据小鼠血清的方阵滴定试验结果，确定纯化果为IgG2a，轻链的亚型均为k链。纯化的McAbTRSV的最佳包被质量浓度为5／~g／mL，按照经SDPAGE电泳分析表明，得到的McAb均有P／N≥2．1的判断标准，免疫小鼠的抗体效价达到2条明显的电泳条带(图6、l，大小分别在53ku和了1：5120以上，可用于细胞融合。通过优化间接22ku左右，与BAIB／c小鼠IgG的重链和轻链理论ELISA方法的各种孵育条件，最终确定抗原的最佳值一致。Westernblot杂交结果显示，6D2细胞株包被条件为37℃孵育1h，放置4℃过夜；一抗的分泌的单克隆抗体均能识别TRsV中的CP蛋白。最佳反应时间为37℃孵育90min；酶标抗体的最阳性杂交瘤细胞株6D2细胞上清分别与用不 602华中农业大学学报第31卷同病毒建立的间接ELISA进行反应，细胞上清与本试验所制备的TRSV单克隆抗体和建立的TRSV的病毒粗提液的ELISA反应时呈阳性，而与检测方法，可为烟草环斑病毒病的快速诊断和检疫其他病毒LoMV、ArMV、LSV、SLRSV的粗提液建工作中的准确检测提供新途径，并能为经济作物的立的ELISA反应时均为阴性，健康植株叶片提取液抗病育种、脱毒种球种苗生产等提供技术支持，同h卯加243Ol3为阴性对照材料，结果表明单抗具有良好的特异性。时，还能为研究烟草环斑病毒病侵染寄主的分子机MI2制提供科学依据。参考文献[1]魏梅生，李桂芬，陈燕芳，等．烟草环斑病毒无侵染性组分的分离l_J]．植物检疫，2000，14(4)：193195．[2]文朝慧，刘箐，王军平，等．从荷兰进境的萝种子中截获烟草环斑病毒[J]．植物检疫，2009，23(6)：34．E3]黄江华，陈秀菊，彭仁，等．烟草环斑病毒研究进展[J]．现代农业科学，2008，215(1)：24—27．[4]魏梅生．斑点免疫金和免疫金／银染色法测烟草环斑病毒[J]．植物检疫，2000，141(1)：12．M．蛋白分子质量标准；1．未纯化的单克隆抗体；2．纯[5]李学湛．烟草环斑病毒粒体细胞间传播过程的电镜观察Lj]．植化的单克隆抗体。^，LProteinmarker；1．Non-purified物病理学报，1990，20(2)：127—129．McAb；2．PurifiedMcAb6D2．[6]封立平，陈长法，孙伟，等．电化学酶联免疫分析法检测烟草花图6SDS—PAGE鉴定纯化的6D2腹水单抗叶病毒和烟草环斑病毒口]．检验检疫科学，2003，13(2)：3-5．Fig．6SDS-PAGEofpurifiedMcAb6D2[7]杨翠云，于翠，张舒亚，等．利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒IJ]_植物检疫，2006，20(1)：31—3讨论34．[8]杨翠云，曹洁，于翠，等．烟草环斑病毒RT-PCR和10RTPcR烟草环斑病毒是中国检疫性有害生物，无论是检测方法的研究口]．上海农业学报，2007，23(1)：83—87．检疫工作还是常规检验都需要大量抗血清完成初期[9]易汪雪，陈舜胜，杨翠云，等．单管实时荧光R％PCR方法同时的EIISA鉴定。目前，国内制备的抗血清都是多抗检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒[J]．植物血清，不仅特异性差、效价低，而且劳动强度大。本病理学报，2011，41(1)：85—92．试验采用生物信息学的方法，综合预测了TRsV外[1O]孙宝华，蔡红，陈海如，等．R~PCR方法检测烟草环斑病毒的壳蛋白主要分布于B转角结构和无规则卷曲区域、研究[J]．云南农业大学学报，2001，16(1)：13—15．[儿]相宁，孙彤，刘宏迪，等．烟草环斑病毒PCR产物的克隆和部分亲水性和表面可及性参数较高区域，分别位于C端序列分析[J]．植物检疫，1998，12(5)：260—263．3194328、384~388、420~430、480~487、495～511[12]陈燕芳，陈京，宋淑敏，等．炳草环斑病毒的检疫检测方法[J]．位氨基酸残基附近的抗原表位。TRSV外壳蛋白抗植物检疫，1999，13(4)：215—217．原表位的分析结果，可为制备具有强免疫性免疫原[13]朱常香，宋云枝．烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗和获得特异性强且灵敏度高的抗血清提供理论依血清的制备[J]．中国病毒学，2005，20(4)：434—437．据，研究成果的应用将有望改变我国一直进口高价[14]乔艳艳，杨翠云．烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达_J]．华中农业大学学报，2008，27(3)：345血清的被动局面。349．单克隆抗体制备周期长、环节多，影响因素也较[15]明艳林，李梅．RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立_J]．福多。霉菌和支原体的污染问题非常严重，直接影响建农林大学学报，2003，32(3)：345—347．了抗体的制备。本试验在后期培养过程中，由于胎[16]徐志凯．实用单克隆抗体技术[M]．西安：陕西科学技术出版牛血清含有支原体导致丢失了3株阳性杂交瘤细胞社，1992：27—125．株，在今后的试验中应随时观察，防止此类事情再次rl7]SAMBROOKJ，FRISTSCHE，MANIATIsT．Molecularclo—ning：alaboratorymanual[M]．3rded．NewYork：ColdSpring发生。另外，本试验所获得的TRSV单克隆抗体尚HarborLaboratoryPress，2003．未对各抗原表位的免疫效果进行分析，但可在下一[18]CHANGHJ，SHEUSY，IOSJ．Expressionofforeignanti—步的试验中进行更深入研究，并且与完整的CP进gensonthesurfaceofEscherichiacolibyfusiontotheouter行比较，以便更精确地判断抗原表位所处的区域。membraneprotein[J]．JBiomedSci，1999，6(1)：64—70． 第5期秦绍钊等：基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备603MonoclonalantibodypreparationofTobaccoringspotvirusbasedonantigenicepitopes、QINShao—zhao’HEYue-qiuLIMinLEIQu-wen'。WANGGuang—yong。DINGYuan-rning。1．CollegeofPlantProtection，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China；2．TechnicalCenter，YunnanEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Kunming650228，China；3．CollegeofLifeScienceandTechnology，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650224，ChinaAbstractByusingbioinformaticssoftware，thedomainofantigenicepitopesonTobaccoringspotvirus(TRSV)coatproteinwasanalyzedandpredicted，andtheepitopeswerefoundtobelocatednear319—328，384—388，420—430，480—487，495—511aminoacidresiduesatC—termina1．Afterthetargetedflag～ment、wasamplifiedbyRT-PCRbasedonthespecificprimers，theexpressionvectorwasconstructedandthemonoclonalantibodywaspreparedwiththefusionproteinandhybridoma．TheantiserumpreparedwiththefusionproteinreactedspecificallywiththeexpressedproductofTRSVCCatproteininE．c0li．Theantiserumhadhighspecificityandmaybeappliedtoquarantineandinspection．KeywordsTobaccoringspotvirus(TRSV)；antigenicepitope；prokaryot：．cexpression；fusionprotein；monoclonalantibody(McAb)(责任编辑：陈红叶)