southern杂交技术

《southern杂交技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、Sourthern杂交技术摘要：使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入的外源基因的拷贝数。以含有外源基因的水稻转基因植株叶片为材料，CTAB法少量抽提总DNA，总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上，最后与地高辛标记的探针进行杂交。通过条带的有无来判断是否为含有外源基因的转基因植物，条带的多少反映了转基因植株中外源基因的拷贝数。结果：关键词：抽提酶切转膜探针杂交Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有

2、一些其他的方法可以代替Southern杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标记系统试剂盒等。1.2水稻总DNA的少量抽提CTAB法抽提DNA步骤：(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5´CTAB，混匀；(3)65ºC水浴中放置30分钟以上，每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性，促进内溶物释放)；(

3、4)12000g离心2分钟；(5)吸取600ml上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色；(6)12000g离心5-10分钟；(7)吸取450ml上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3MNaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现；(8)12000g离心10分钟；(9)弃去上清，用500ml75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g离心5分钟，弃上清,自然干燥；(10)加入50mlTE（含20mg/mlRNaseA），放于4ºC溶解；(11)充分溶解

4、后，测定并调整浓度。1.3总DNA质量检测及酶切取1mlDNA于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（DNA1ml+上样缓冲液2ml+ddH2O7ml），将DNA浓度调节至300-400ng/ml。配制酶切体系20ml，其中10mlDNA、1mlHind(10U/µl)2ml10×buffer、7mlddH2O。混匀，短暂离心；37℃下温浴1-2小时，加入上样缓冲液终止反应，取1ml电泳检测酶切效果。1.4琼脂糖凝胶电泳及转膜盐转移法：(1)琼脂糖凝胶电泳：1×TAE配制250ml0.8%的琼脂糖凝胶，点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组样品。(2)转

5、膜前准备：2个水盘、1根玻璃棒、1块铲胶板、1个切胶刀、2张搭盐桥的滤纸（13cm×35cm)、1张合适大小的尼龙膜(7cm×10cm)、2张比尼龙膜稍大的滤纸(7.5cm×10.5cm)、一叠5cm左右厚的吸水纸(8cm×11cm)、1大1小2块玻璃板；试剂：0.125MHCl、1.5MNaCl/0.5MNaOH、1.5MNaCl/0.5MTris、20×SSC(3)凝胶的预处理:电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角作为电泳方向记号；把凝胶翻面，放入加有足量的0.125MHCl玻璃盘中，轻轻摇动约10min，使电泳指示剂溴

6、酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）；倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶；倒去蒸馏水，加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动变性30min；倒去变性缓冲液，加蒸馏水漂洗；倒去蒸馏水，加入足量的中和缓冲液（Tris/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动30min中和；倒去中和液，蒸馏水漂洗；20×SSC中平衡10min以上。另一玻璃盘中加入足量的转膜缓冲液(20×SSC)，放上洗净的玻璃板，用2-3张滤纸放在玻璃板上，两端浸入转膜液中搭制盐桥；在盐桥滤纸上洒些转膜液，立即将胶放在盐桥上（注意凝胶与盐桥之间不要有气泡），胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路

7、（即放置吸水纸与盐桥相接）；小心将膜覆盖在凝胶上；膜上放2张滤纸，滤纸上放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约350g的重物，转膜过夜(4)烘膜:转膜完毕，将膜小心取下，2×SSC短暂漂洗，用两张滤纸包住膜，置于真空干燥箱中，80℃固定2h或120℃30min，用EB染胶以检测转移效果。1.5地高辛标记探针sourthern杂交(1)地高辛标记探针：10µl，将300ng模板DNA用无菌去离子水补足至8µl；沸水浴或干浴98ºC10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却；充分混匀DiG-highPrimer（1#管），并取2µl至变性DNA管，混匀

8、并离心；37ºC温育1小时或过夜；停止反应，65ºC加热10分钟。(2)地高辛标