实验十一 Southern杂交分析

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1、11.植物基因组DNA的Southern杂交1、植物基因组DNA的提取与纯化2、植物基因组DNA的酶切3、酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southernblotting4、探针序列的获得与标记5、探针与基因组DNA的杂交6、杂交信号的检测主要步骤一、Southernblotting（变性DNA转移到膜上）盐转：20×SSC为转移液，转移后DNA不能与尼龙膜共价结合，需要紫外交联。碱转：0.4MNaOH为转移液，转移后的DNA可直接与带正电荷的尼龙膜共价结合。带正电荷的尼龙膜分子量大于8kb的DNA分子，从凝胶转移到膜上的效率很低，所以需要把大片段DNA打断成较

2、小的片段，以方便转移。紫外线照射打断大分子量DNA利用脱嘌呤方法打断DNA分子注：所有操作均需带手套进行！脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤脱嘌呤液中和液变性液0.25MHCl0.5MNaOH1.5MNaCl0.5MTris-HCl1.5MNaClPH7.5标准柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）0.3M柠檬酸三钠3MNaCl酶切基因组DNA的凝胶电泳1、配制0.8%或者1.0%的琼脂糖凝胶，注意胶的厚度和胶孔大小是否合适，在能满足需要的情况下，胶浓度越低、胶越薄越好。2、点样，基因组DNA酶切电泳一般用λ/HindIII作为DNA分子量标记。建议干点，即先加入与凝胶持

3、平的新的电泳缓冲液，使胶孔里没有液体是点样，之后电泳至样品迁移出胶孔后添加电泳缓冲液至高于凝胶液面1-2mm。3、电泳：先用高电压使样品迁移出胶孔，再改用低电压（1-1.5V/cm）低电压过夜，至溴酚蓝到达凝胶下部1.5-2cm时停止电泳。4、凝胶照相，注意紫外照射时间越短越好；然后对凝胶进行修整，切去胶孔和边缘不含DNA的部分，注意保持边缘齐整，在凝胶正面的右上角切掉一小块以示方向，之后用记录凝胶的长和宽；凝胶处理过程中准备一块与凝胶相同大小的尼龙膜和两张滤纸，在尼龙膜的右上角剪掉一小块以示方向，如有需要，用铅笔在右下角写好编号。琼脂糖凝胶的处理1、若使用

4、碱转法，可以直接将凝胶中大于8kb的部分置于紫外灯下照射10-15分钟后用于转膜。2、若使用盐转法，则按照脱嘌呤步骤进行凝胶的处理。盐转法脱嘌呤步骤1、用0.25M的HCl室温漂洗凝胶至溴酚蓝的蓝色变成黄色（约15min），50rpm；2、用灭菌的双蒸水洗掉凝胶表面的HCL溶液，漂洗5min；3、用变性液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm（使DNA变性），之后用蒸馏水漂洗凝胶；4、用中和液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm，之后用蒸馏水漂洗；5、在20×SSC中平衡凝胶10min，等待转膜。6、剪好的膜先用灭菌的蒸馏水润湿（膜漂浮在液面上

5、），然后在2×SSC中平衡（膜可以没入溶液中）。滤纸用2×SSC润湿。滤纸桥凝胶尼龙膜吸水纸重物支撑架滤纸转移液毛细管转移Southern转膜过程1、找一块比凝胶大的平台（如大型的制胶板），放入适当的托盘中，加入20×SSC转移液。2、平台上铺一层比凝胶稍大的用20×SSC浸透的厚滤纸或2-3层普通滤纸，滤纸两头接触到托盘中的20×SSC溶液。滤纸和平台之间不能有气泡。。3、将凝胶正向放于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。4、用保鲜膜围绕凝胶周边，但不要覆盖凝胶，以此作为屏障，防止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中（液流“短路”现象是导致凝

6、胶中的DNA的转移效率下降的主要原因）。5、切一叠（5-8cm高）与滤纸同等大小的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在上方放一块玻璃板，玻璃板上压重物，使DNA转移持续过夜（可转移5-8小时）。6、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，将湿润的尼龙膜直接进行紫外交联固定DNA到尼龙膜上。对转移后的凝胶，可在紫外透射仪上观察是否还有残留的DNA。转移方法和膜注意事项：1、凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题，EB也可以加入到样品中。2、所有普通类型的DNA转移方法都适

7、用于后续的地高辛杂交实验。3、根据我们的经验，用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。4、碱性转移（如在0.4MNaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker的转移。DNA的转移和固定如果你想采用那么紫外交联的方法（尼龙膜）将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后自然晾干后保存，也可以直接进入预杂交步骤。，烘烤（尼龙膜）在2×SSC简单的洗涤一下膜将尼龙膜放在120℃下烘烤30分钟或者根据操作说明的要求进行操作。

8、，烘烤（尼龙膜）在2×SSC简单的洗涤一下膜将尼龙膜