抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

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1、抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究作者：胡廷辉　应敏刚　郑秋红　龚福生　谢云青　树突状细胞是已知功能最强的抗原呈递细胞，是机体T淋巴细胞特异免疫应答的直接启动和调控者，在机体的抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。在体外培养DC并用肿瘤抗原致敏后，携带肿瘤抗原信息的DC，在体内外激活针对该肿瘤细胞的特异性杀伤细胞。本试验在体外用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC后诱导CIK，通过其对SGC的杀伤作用的研究为DC治疗胃癌的研究提供理论及试验依据。1材料与方法主要试剂SGC由福建省肿瘤医院分子生物学研究室提供；rhIL?

2、鄄2、rhIL?鄄4、CDmAb购自Peprotech公司；rhGM?鄄CSF、Ficoll淋巴细胞分离液购自军事医学科学院；胎牛血清(超级)购自杭州四季青生物制品公司；人AB血清由福建省血液中心提供；1640培养基购自Gibco公司；FITC标记的小鼠抗人CD83、HLA?鄄DR、CD14、CD86及同亚型对照抗体购于晶美生物工程有限公司。1.方法SGC的培养SGC在5％CO2、37℃条件下，用含有10％胎牛血清RPMI1640培养液常规培养。肿瘤细胞总蛋白的获取将培养贴壁肿瘤细胞用胰酶消化悬浮，离心弃上清，用无血清RPMI16

3、40培养液重悬，超声破膜，30000r/min超速离心90min，取上清。浓缩透析，调整蛋白浓度为25mg/ml，经μm滤膜滤过除菌，－80℃保存。的培养[1]无菌条件下采集的正常人抗凝外周全血，经淋巴细胞分离液梯度离心，获取单个核细胞，用含10%AB血清的RPMI1640悬浮细胞，调整细胞浓度至5×107/ml，加1ml至6孔板内培养箱中培养2h，吸掉上清，用培养液洗去非黏附细胞，获得贴壁细胞，每孔再加入3ml含有rhIL?鄄及rhGM?鄄CSF的10%AB血清的RPMI1640培养液，2~3d半量换液1次。抗原负载DC及表型鉴

4、定将上述培养5d的DC用含有rhIL?鄄及rhGM?鄄CSF的10%AB血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml，向6孔板内加入2ml的细胞，每孔加入肿瘤细胞总蛋白1ml，于第8d收集悬浮细胞为抗原致敏的DC。对照组加入无血清RPMI1640培养液1ml，于第8d收集悬浮细胞为空白的DC。分别收集第1d、第5d及第8d抗原致敏的DC，用流式细胞仪检测DC表面分子HLA?鄄DR、CD83、CD86、CD14表达。的培养[2]同前法从外周血中获取单个核细胞，用含10%AB血清的RPMI1640悬浮细胞，37℃、5%C

5、O2培养箱中培养2h，取悬浮细胞，调整细胞数为1×106/ml，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CDmAb(50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液培养，2~3d半量换液1次至第8d。试验组用将其分别与空白的DC及抗原致敏的DC按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CDmAb(0μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液在6孔板内培养。对照组仅用含有IL?鄄2(250U/ml)、CDmAb(50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液在6孔板内培养。5d后分别获取抗原致敏DC诱

6、导CIK，空白的DC诱导CIK及CIK为效应细胞。混合淋巴细胞反应试验组收集成熟经抗原致敏及空白的DC，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CDmAb(50μg/L)10%AB血清的RPMI1640调整细胞数为1×106/ml。收集同时期培养的CTK用同样的培养液调整细胞数为1×107/ml。将100μlCIK分别与100μl经抗原致敏及空白的DC在96孔培养板中混合培养。对照组100μlCIK加入100μl含有IL?鄄2(250U/ml)、CDmAb0μg/L10%AB血清的RPMI1640继续培养。72h后加入四甲基偶氮唑蓝1

7、0μg，继续培养4h，离心弃去孔内上清，每孔加入150μl二甲基亚砜震荡10min，待结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm处测OD值，每组设3个复孔，取均值按下式计算：刺激指数SI=A实验孔/A对照孔×100％细胞杀伤试验用MTT比色法测定抗原致敏DC诱导CIK，空白的DC诱导CIK及CIK对SGC细胞的杀伤活性，效靶比为5：1、10：1、20：1。调整细胞至所需浓度，各取100μl的效靶细胞悬液加入96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，加入四甲基偶氮唑蓝10μg，继续培养4h，离心弃上清，每孔加入150μl二甲基

8、亚砜震荡10min，待结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm处测OD值，同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔设3个复孔，取其均值按下式计算：CIK细胞毒性＝[1－/A靶]×100%1.统计学方法采用软件对数据进行析因分析及t检验。结果.1D