第21章 常用分子生物学技术的原理及其应用

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1、第21章常用分子生物学技术的原理及其应用学习要求1．掌握分子杂交、印迹技术、PCR技术、核酸序列分析技术、基因文库构建的基本原理及应用；基因诊断、基因治疗的基本概念。2．熟悉生物大分子相互作用的研究技术；基因诊断的方法；基因治疗的策略和程序。3．了解生物芯片技术、遗传修饰动物模型的建立及应用、疾病相关基因的克隆与鉴定。基本知识点本章简要介绍了目前医学分子生物学中的部分常用技术。主要内容包括：分子杂交技术、印迹技术、PCR技术、核酸序列分析技术、基因文库构建的基本原理及应用、生物芯片技术、生物大分子相互作用研究技术、遗传修饰动物模型的建立及应用、疾病相关基因的克隆与鉴定

2、以及基因诊断和基因治疗技术。印迹技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它主要包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术。DNA印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析。RNA印迹技术主要用于检测某一组织中或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可比较基因的表达情况。蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性的蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。其它方法还有斑点印迹、原位杂交、DNA芯片技术等。PCR技术以拟扩增的DNA分子为模板，以一对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作

3、用下，依半保留复制机制沿模板链延伸直至完成两条新链的合成。重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应体系的基本成分包括：①模板；②DNA；③特异引物；④耐热DNA聚合酶；⑤dNTP；⑥含Mg2+的缓冲液。PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。该技术具有高敏感、高特异、可重复以及快速简便等优点。PCR技术主要用于：①目的基因的克隆；②基因的体外突变；③DNA和RNA的微量分析；④DNA序列测定；⑤基因突变分析等。核酸序列分析技术有手工测序和自动测序，其原理主要建立在化学裂解法或DNA链末端合成终止法的基础上。目前广泛应用的是DNA自动测序。基因文库是指一

4、个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。其可分为基因组DNA文库和cDNA文库。17生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。生物芯片技术是一项新的规模化生物信息分析技术。该技术主要应用包括基因表达检测、基因突变检测、基因诊断、功能基因组研究、基因组作图和新基因发现等多个方面。生物大分子之间形成的各种复合物，在生命活动中起着重要作用。研究各种生物大分子相互作用方式的相关技术，也变得日益重要。酵母双杂交和标签蛋白沉淀是目前分析蛋白质相互作用的主要手段。电泳迁移率变动测定和染色质免疫沉淀法是研究DNA-蛋白质相互作用的重要分析技术。转基因动物、动物整体克隆技术、基因剔除技术在

5、建立疾病的动物模型、探讨疾病的发生机制方面具有重要价值。从基因水平研究疾病的发病机制，采取针对性措施治疗患者，是医学日后发展方向。基因诊断和基因治疗已成为现代医学的重要内容。17一、选择题（一）A型题1．分子杂交实验不能用于A．单链DNA与RNA分子之间的杂交B．双链DNA与RNA分子之间的杂交C．单链RNA分子之间的杂交D．单链DNA分子之间的杂交E．抗原与抗体分子之间的杂交2．关于探针叙述错误的是A．带有特殊标记B．具有特定序列C．必须是双链的核酸片段D．可以是基因组DNA片段E．可以是抗体3．下列哪种物质不能用作探针A．DNA片段B．cDNAC．蛋白质D．氨基酸

6、E．RNA片段4．印迹技术可以分为A．DNA印迹B．RNA印迹C．蛋白质印迹D．斑点印迹E．以上都对5．PCR实验延伸温度一般是A．90℃B．72℃C．80℃D．95℃E．60℃6．Westernblot中的探针是A．RNAB．单链DNAC．cDNAD．抗体E．双链DNA7．Northernblotting与Southernblotting不同的是A．基本原理不同B．无需进行限制性内切酶消化C．探针必须是RNAD．探针必须是DNAE．靠毛细作用进行转移8．可以不经电泳分离而直接点样在NC膜上进行杂交分析的是A．斑点印迹B．原位杂交C．RNA印迹D．DNA芯片技术E．D

7、NA印迹9．下列哪种物质在PCR反应中不能作为模板A．RNAB．单链DNAC．cDNAD．蛋白质E．双链DNA10．RT-PCR中不涉及的是A．探针B．cDNAC．逆转录酶D．RNAE．dNTP11．关于PCR的基本成分叙述错误的是A．特异性引物B．耐热性DNA聚合酶C．dNTPD．含有Zn2+的缓冲液E．模板1712．DNA链末端合成终止法不需要A．ddNTPB．dNTPC．引物标记D．DNA聚合酶E．模板13．cDNA文库构建不需要A．提取mRNAB．限制性内切酶裂解mRNAC．逆转录合成cDNAD．将cDNA克隆入质粒或噬菌体E．重组载体转化宿