常用分子生物学技术的原理及应用

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1、第六章常用分子生物学技术的原理及应用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:principleandapplication第一节分子生物学发展概述分子生物学molecularbiology是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。1950年，Astbury在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理的一门科学。概述一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，“遗传学之父”G.Mendel

2、根据豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说，即遗传的分离律和自由组合律。（2）1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗传单位的载体的概念。（3）1909年，W.Johannsen将这种在染色体上的遗传单位定名为基因（gene）。（4）1910年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离出细菌DNA，并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。（6）1950年，Astbury在一次演讲中，首次使用了“分子生物学”术语。（7）1953年，Watson和Crick提出

3、了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick等人破译了DNA遗传密码，1966年破译了64个遗传密码。提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。（9）1969年，JonathanBeckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因。（10）1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操纵子学说。（11）1970年，发现了逆转录酶。（12）自1946年起的20年当中，陆续发现了许多质粒；1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶，为DNA体外重组提供了有利工具。（13）1973年

4、，重组DNA技术问世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术（15）1990年，人类基因组计划。DNA的结构、复制、中心法则基本构成单位是核苷酸核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。碱基分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构2.一些重要理论importanttheory五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)；碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧啶RNA为单链，不是双链，但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色体以外的质

5、粒中(质粒是一些双链，闭环的DNA分子)。RNA与DNA有如下不同点：DNA(或RNA)结构给我们的启示①DNA(或RNA)是水溶性的。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们保留的是水相、而不是有机相。②核酸是两性电离，既带正电荷，又带负电荷。它的等电点(PI)为2～2.5。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉)③DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、质粒)，所以应注意提取方法的不同④由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率不同。⑤根

6、据碱基互补配对原则，可设计引物和探针杂交。⑥由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。在解旋酶的作用下，打开DNA双链在特定的复制起始点以每条DNA链为模板在DNA聚合酶的催化下以4种脱氧核苷酸为前体物，合成一条互补DNA链。DNA的复制称为半保留复制。DNA的复制DNA半不连续复制①PCR技术的原理：在体外要靠温度(90℃以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为模板，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。②检测核分裂指数：在细胞培养中，加

7、入3H标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。DNA的复制给了我们一些启示遗传信息的传递是：DNA→RNA→多肽(蛋白质)在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达(expression)。中心法则中心法则反义链转录(transcription)反义链有意义链转录(transcription)以DNA为模板，合成RNA的过程。非模板链称为有意义链，而模板