多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用课件

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1、iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用发育生物学2011王斐研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析.近年来在体内和体外同位素标记基础上用多维液相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一Introduction相对和绝对定量同位素标记(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项新

2、的体外同位素标记技术.使用该技术可以寻找差异表达蛋白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定.如今，iTRAQ技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用IntroductionIntroductioniTRAQ的8种同位素标记试剂由8种(或4种)相对分子质量均为305的等量异位标签分子组成Theory(iTRAQ)报道基团(reportergroup)113114115116117118119121平衡基团(balancegroup)1921911901891881871

3、861841个相同的反应基团(reactivegroup)Theory(iTRAQ)化学标签组成肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个Lys侧链相连，可标记所有酶解肽段，在其上8种报告基团通过平衡基团与反应基团相连．报告基团和平衡基团的平衡分子量都为305，因此改变任一iTRAQ试剂，不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量都完全相同.而在串联质谱中，同重元素标记肽段自所示虚线部分裂解，平衡基团在二级质谱发生中性丢失.信号离子表现为不同质荷比(113～121)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息Theor

4、y(iTRAQ)Theory(iTRAQ)生物质谱用于蛋白鉴定的基本原理Theory(MALDI-TOF)二级质谱用于蛋白鉴定的基本原理Theory(MALDI-TOF)Theory(MALDI-TOF)Theory(MALDI-TOF)Theory(MALDI-TOF)Methods还原蛋白和封闭半胱氨酸每管样品中含蛋白样品5-100µg。（1）每个样品管中加入20μL溶解缓冲液和1μ变性剂↓（2）漩涡震荡混匀↓（3）每个样品管中加入2μL还原试剂↓（4）漩涡震荡混匀，短暂离心↓（5）在60℃水浴中保温1hr↓（6）短暂离心。

5、↓（7）每个样品管中加入1μL半胱氨酸封闭剂↓（8）漩涡震荡混匀，短暂离心↓（9）室温放置10minMethods2.胰酶消化蛋白（1）在每个新的胰酶瓶中加入25μL超纯水溶解胰酶↓（2）漩涡震荡使胰酶充分溶解，短暂离心↓（3）每个样品管中加入2~10μL胰酶溶液。↓（4）漩涡震荡混匀，短暂离心↓（5）37℃保温过夜（12~16hrs）Methods3.iTRAQ试剂标记胰酶消化产物（1）将iTRAQ试剂平衡至室温。↓（2）短暂离心使溶液集中在管底。↓（3）每管iTRAQ试剂中加入50μL异丙醇。↓（4）漩涡震荡混匀，短暂离

6、心。↓（5）将每管iTRAQ试剂加入相应要标记的样品中。↓（6）震荡混匀，短暂离心↓（7）如果混合后的溶液pH<7.5，则加入5μL溶解缓冲液↓（8）室温静置2hrs。↓（9）混合标记样品到一管中，漩涡震荡混匀，短暂离心4.通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品Methods4.通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品(1)混合标记样品过柱子，使标记的肽端吸附于柱子上（2）配置不同浓度的盐溶液洗脱液2030405060708090100125150175200350mM（3）浓度不同的洗脱液分别冲柱，收集不同的洗脱液，标清洗脱液浓度（4）利用旋转蒸发仪将洗脱

7、液蒸干，用流动相A（通常是10μL，98%水2%乙腈0.01%的TFA）将肽端溶解（5）上样点靶（含有基质和流动相），根据检测器的峰确定哪些点含有蛋白片段（6）通常10μL样品混合基质和流动相会点半个板，约600个点（7）风干Methods4.通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品Methods5.质谱检测肽端的标签和含量差异Methods5.质谱检测肽端的标签和含量差异MethodsAdvantage双向凝胶电泳技术对疏水性蛋、分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量很低的蛋白难于分离或不能分离，而对于这些蛋白使用基于液相色谱及质谱技术的相对与绝对定

8、量同位素标签技术（IsotopeTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation，iTRAQ）