质谱技术在蛋白质鉴定中的应用课件

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1、质谱技术在蛋白质鉴定中的应用内容质谱的发展背景质谱分析原理及质谱仪质谱技术在蛋白质鉴定中的应用串联质谱鉴定蛋白质方法蛋白质鉴定的算法（Sequest）一、发展背景1813年：Thomson使用MS报道了Ne是由22Ne和24N两种同位素组成；随后，同位素分析开始发展。在30年代末：由于石油工业的发展，需要测定油的成份。通常用蒸馏的方法先分离这些烃类混合物，然后再分别测定其折光率的方法来分析它们。这通常要花数天时间。40年代初：开始将MS用于石油工业中烃的分析，并大大缩短了分析时间。50年代初：质谱仪器开始商品化，并广泛用于各类有机物的结构分析。同时质谱方法与

2、NMR、IR等方法结合成为分子结构分析的最有效的手段。80年代：非挥发性或热不稳定分子的分析进一步促进了MS的发展。90年代：由于生物分析的需要，一些新的离子化方法得到快速发展；目前一些仪器联用技术如GC-MS，HPLC-MS，GC-MS-MS，ICP-MS等正大行其道。蛋白质的分析研究内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析

3、的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位。蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位

4、置。二、质谱分析原理及质谱仪1、基本原理概述质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。其过程为可简单描述为：其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，V为电子运动速度。离子源轰击样品带电荷的碎片离子电场加速(zeU)获得动能(1/2mV2)磁场分离(m/z)检测器记录2、质谱仪性能指标1.质量测量范围质量测定范围以原子质量单位量度，1个原子质量单位：1u=1.6605410-27kg/12C原子如12C=12u,CH4=16.xxxxu在非精确测量中，常直接以原子或分子量大小来表示。

5、2.分辨本领指质谱仪分辨相邻质量数离子的能力。定义为：两个相等强度的相邻峰(质量分别为m1和m2)，当两峰间的峰谷不大于峰高的10%时，则可认为两已分开，其分辨率R为：可见在质量数小时，分辨率亦较小。实际工作中很难找到上述两相等的峰，常以表示，其中W0.05表示峰高5%处的峰宽。R与离子通道半径r、加速器和收集器狭缝宽度、离子源的性质和质量等因素有关。3、仪器组成按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定磁场（单聚焦及双聚焦质谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质谱仪）。MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。1）

6、.真空系统如图所示，质谱仪中所有部分均要处于高度真空的条件下(10-4-10-6托或mmHg柱),其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起：a）大量氧会烧坏离子源灯丝；b）引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化；c）干扰离子源正常调节；d）用作加速离子的几千伏高压会引起放电。2）.进样系统对进样系统的要求：重复性好、不引起真空度降低。进样方式：a)间歇式进样：适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。如图所示。注入样品(10-100g)—贮样器(0.5L-3L)—抽真空(10-2Torr)并加热—样品蒸汽分子(压力陡度)—漏隙—高真空离子源。1.

7、3-0.13Pa（加热）b)直接探针进样：高沸点液体及固体探针杆通常是一根规格为25cm6mmi.d.，末端有一装样品的黄金杯(坩埚)，将探针杆通过真空闭锁系统引入样品，如图所示。优点：1）引入样品量小，样品蒸汽压可以很低；2）可以分析复杂有机物；3）应用更广泛。c)色谱进样：利用气相和液相色谱的分离能力，与质谱仪联用，进行多组份复杂混合物分析。3.电离源（室IonizationChamber）将引入的样品转化成为碎片离子的装置。根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：气相源：先蒸发再激发，适于沸点低于500oC、对热稳定的样品的离子化，包

8、括电子轰击源、化学电离源、场电离源、火花源；解吸源：