抗菌肽cecropin

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1、抗菌肽cecropin：沈益劳学刚耿伟张洪祖徐贤秀【摘要】在TNFα基因3′端连接抗菌肽cecropin-Xm基因多拷贝串联体，与温度诱导的表达载体pRCs组成表达载体pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)，并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)。SDS-PAGE结果显示，在同样表达条件下应用BL21(DE3)/pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)2表达系统可获得比BL21(DE3)/pRCs-TNFα-cecropin-Xm系统多出一倍的目的物cecropin-Xm。融合

2、蛋白经Br切割后用CM52纤维素柱分离纯化得到纯度大于95%的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin-Xm，体外MTT抑瘤实验表明cecropin-Xm具有广谱杀灭肿瘤细胞的作用并且对正常细胞影响极小。【关键词】抗菌肽；Cecropin-Xm；基因串联；抑瘤作用抗菌肽cecropins是瑞典科学家Boman于1980年首先从惜古比天蚕中发现的［1］，后来在其它蚕类、昆虫和哺乳动物［2，3］中发现了各种类型的抗菌肽，其中包括多种cecropin类的抗菌肽。抗菌肽cecropins一般由33～39个氨基酸组成，具有高度的同源性，对革兰阳性菌和阴性菌都有杀伤力，对正常真核细胞没有影响［

3、4］。有实验表明，抗菌肽的作用对象和作用机制各异，其中某些抗菌肽可以通过引起肿瘤细胞凋亡［5］和激活经典的补体途径等来杀伤肿瘤细胞［6］。为了更好的研究cecropin类的抗菌肽，本实验室参照抗菌肽CMIV［7］的氨基酸序列，用化学方法合成了编码抗菌肽CMIV突变体cecropin-X的cDNA［8］，并在大肠埃希菌中进行表达研究［9］。为了获得易于后期纯化且稳定的表达系统，在pRC系统［10］中完成了抗菌肽cecropin-X基因与TNFα(天然型肿瘤坏死因子)的融合表达［11］。为了从源头上提高抗菌肽的产量，首先利用PCR方法在cecropin-X基因末端加入了甲硫氨酸的密

4、码子，得到了cecropin-Xm基因；再将cecropin-Xm基因串联在TNFα基因的3′-端。在此基础上，完成了TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的串联表达，纯化得到了与cecropin-X具有同样抑菌活力的高纯度的cecropin-Xm。在体外实验中，cecropin-Xm对多种人源肿瘤细胞表现出明显的抑制作用。1材料和方法1.1材料1.1.1菌种和质粒克隆宿主菌E.coliTOP10，表达宿主菌E.coliBL21(DE3)由本实验室保存；测活菌E.coliK12D31由斯德哥尔摩大学Boman教授馈赠；质粒pRC(含PR启动子的原核高效表达载体

5、，温度诱导表达)由中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授馈赠［10］。1.1.2酶、试剂和层析介质各种限制性内切酶和T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、琼脂糖均购自TaKaRa公司；酵母抽提物和胰蛋白胨为英国Oxoid公司产品；Br为Sigma公司产品；氨苄西林购自上海新先锋制药厂；SEPerfect100bpDNAladder购自上海申能博彩公司；SDS-PAGE分子量标准蛋白购自中科院生化所；低分子量标准蛋白质为Promega公司产品；其它化学试剂均为国产分析纯；CM-52纤维素购自AmershmaPhamacia公司。PCR引物合成和基因测序由上海申能博彩公司完成。1

6、.1.3细胞株人肝癌细胞HepG2和QGY-7703、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞LOVO、人宫颈癌细胞Hela、人白血病细胞U937和HL60由本实验室保存；人胚肝细胞HL-7702由东南大学遗传中心谢维教授馈赠。PRMI1640购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程公司；MTT购自Sigma公司。1.1.4主要仪器和设备SCS-24型摇床(上海市离心机械研究所)；5415R型台式离心机(Eppendorf公司)；PTC-100型PCR仪(Bio-RAD公司)；1100System高效液相色谱仪(Agilent公司)；SAFIRE型多功能酶标仪(TECA

7、N公司)。1.2方法1.2.1表达载体pRCs的获得(1)取质粒pRC用EcoRI和PstI酶切后回收；(2)合成互补的寡核苷酸链①5′-AATTCGTCGACGGATCCCTGCA-3′和②5′-GGGATCCGTCGACG-3′，加入T4DNA连接缓冲液，85℃加热5min后自然冷却至室温；(3)将(1)和(2)的产物连接后转化入E.coliTOP10感受态细胞中，涂布LB(含氨苄西林100μg/ml，如无特殊说明以下同)平板，30℃培养过夜；(4)对随机挑选的5个克隆进行测序鉴定。1.