产抗菌肽乳酸菌筛选与抗菌肽异源表达

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1、硕士学位论文产抗菌肽乳酸菌筛选与抗菌肽异源表达SCREENINGOFLACTICACIDBACTERIAPRODUCINGANTIBACTERIALPEPTIDESANDHETEROLOGOUSEXPRESSIONOFANTIBACTERIALPEPTIDES吕晓萌哈尔滨工业大学2015年6月国内图书分类号：TS252.54学校代码：10213国际图书分类号：579密级：公开工学硕士学位论文产抗菌肽乳酸菌筛选与抗菌肽异源表达硕士研究生：吕晓萌导师：崔艳华副教授申请学位：工学硕士学科：食品科学所在单位：化工学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大

2、学ClassifiedIndex:TS252.54U.D.C:579DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringSCREENINGOFLACTICACIDBACTERIAPRODUCINGANTIBACTERIALPEPTIDESANDHETEROLOGOUSEXPRESSIONOFANTIBACTERIALPEPTIDESCandidate：LvXiaomengSupervisor：AssociateProf.CuiYanhuaAcademicDegreeAppliedfor：MasterofEngineering

3、Speciality：FoodScienceAffiliation：SchoolofChemicalEngineeringDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学工学硕士学位论文摘要抗菌肽由于其抑菌谱广、抑菌作用明显、不易产生耐药性等特点而逐渐成为一种能够代替抗生素的极具市场前景的抗菌药物。乳酸菌分泌的抗菌肽，具有无毒、无残留、稳定性好、高效等优点，为天然食品防腐剂，已成为当前研究的热点。但是由于乳酸菌抗菌肽产量相对较低，成本

4、较高，未能广泛应用于食品工业。本研究从传统发酵乳制品（马奶酸奶粉和干酪）中分离乳酸菌，旨在从中筛选产抗菌肽的优良菌株，并采用基因工程手段，在大肠杆菌中异源表达，为大量获得乳酸菌抗菌肽提供途径。本研究（1）从传统发酵乳制品（马奶酸奶粉、干酪）中分离获得了79株乳酸菌。以单核李斯特菌为指示菌，从中筛选出8株抑菌效果较好的菌株。采用生理生化鉴定和16SrRNA菌种鉴定，确定其中6株为植物乳杆菌，其余两株为屎肠球菌。（2）采用双层牛津杯法确定上述8株菌株效价，确定了最优菌株1-4和2-2，以其作为实验材料，优化乳酸菌产抗菌肽的条件。结果显示，抗菌肽合成的最佳条件为：

5、培养时间12h-16h，培养温度37℃，发酵液原始pH值6-7，菌龄14h，接种量108CFU/mL。此条件下，乳酸菌菌体浓度最大，抗菌肽产量最高。（3）根据抗菌肽PlantaricinE、PlantaricinF核苷酸序列设计引物扩增片段，与pCold-SUMO连接构建重组质粒，并进行诱导表达。诱导表达条件优化实验，最终确定宿主菌为ArcticExpressE.coli，诱导时间8h，诱导温度15℃，IPTG浓度0.2mM。超声破碎验证目标蛋白在上清液中表达，无包涵体产生，采用非变性条件纯化。与Ni-NTA树脂结合后发现，目标蛋白与杂蛋白完全分开，且浓度较

6、大。pCold-SUMO-plnE表达的融合蛋白成功切割组氨酸标签，pCold-SUMO-plnF表达的融合蛋白则未切开。抑菌实验研究发现，与植物乳杆菌菌液对比，两种融合蛋白菌体破碎上清液抑菌效果不明显，融合蛋白纯化后有抑菌圈出现，且酶切his-SUMO-tag标签前后抑菌活性无明显变化。综上，本研究结果表明，抗菌肽PlantaricinE、plantaricinF基因在大肠杆菌中成功表达，表达后的融合蛋白经纯化对单核李斯特菌均有抑菌效果。表达后抗菌肽产量提高，为获得大量抗菌肽提供了途径，将促进乳酸菌抗菌肽的广泛应用。关键词：抗菌肽；筛选；重组质粒；异源表达

7、；抑菌I哈尔滨工业大学工学硕士学位论文AbstractAntimicrobialpeptidesgraduallybecomeapromisingdrugforthefuturebecauseofitswideantimicrobialspectrum,obviousantimicrobialactivityanddrugresistance.Lacticacidbacteriasecreteantimicrobialpeptides,alsoknownasacteriocins,whicharenon-toxic,noresidue,goodstabili

8、tyandotheradvantagesbelong