肺炎克雷伯杆菌产β

《肺炎克雷伯杆菌产β》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、肺炎克雷伯杆菌产β【关键词】肺炎克雷伯杆菌；质粒；耐药性检测【Abstract】ObjectiveToexplorethemechanismsofresistanceplasmidinKlebsiellapneumoniae.MethodsAntimicrobialsusceptibilitytestingofKlebsiellapneumoniaeisolatesedusingagardilution,plasmidDNAidation.Results31strainsofKlebsiellapneumoniaeisolatesexhibitresistanceinsomeextent

2、tocephalosporin,ampicillinandazithromycin.Tids,2.3kband8.2kb,toniaeisolates.ConclusionDrugresistanceofKlebsiellapneumoniaeisolatesinedbyRplasmids.【Keyoniae;plasmid;drugresistanttest肺炎克雷伯杆菌是造成医院内感染和社区感染的重要致病菌。随着各种新型广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用，细菌的耐药性也在逐年上升，并且出现了多重耐药现象。质粒介导的产β-内酰胺酶而导致细菌耐药是肺炎克雷伯杆菌耐药的重要原因之一［1］。同

3、时质粒介导的耐药性可通过细菌间接合、转化和转导等形式进行耐药性的传播，从而造成耐药菌株的流行。肺炎克雷伯菌质粒介导的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）耐药基因也已经被发现［2］。因此，质粒介导的耐药性的研究已经成为研究的热点。本研究对31株临床分离的肺炎克雷伯杆菌进行了耐药性检测，对耐药菌株进行了质粒的提取及鉴定。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株肺炎克雷伯杆菌于2005年11月～2006年6月吉林大学附属中日联谊医院和长春中医药大学附属医院分离并鉴定。受体菌：大肠杆菌JM109由本实验室保存。1.1.2药品和试剂氨苄西林（购自华北制药股份有限公司），头孢拉定、头孢噻肟钠﹑头孢哌酮钠﹑

4、头孢曲松钠（购自上海新先锋药业有限公司），阿奇霉素（购自杭州澳亚生物技术有限公司），超广谱β-内酰胺酶测定盒（购自杭州天和微生物试剂有限公司），酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）（购自BioFlux公司），普通营养琼脂培养基（购自杭州天和微生物试剂有限公司）。质粒提取液（按文献［2］配制）溶液Ⅰ：含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/LTris·Cl（pH8.0）,10mmol/LEDTA；溶液Ⅱ：含0.2mol/LNaOH和1%SDS（现用现配）；溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，HAc11.5ml，水28.5ml配制成100ml的溶液。1.2方法1.2.1抗生素敏感试验采用琼脂

5、稀释法检测阿奇霉素、氨苄西林、头孢拉定、头孢噻肟、头孢哌酮和头孢曲松6种抗生素对31株肺炎克雷伯杆菌的MIC50和MIC90。1.2.2质粒DNA的抽提采用碱裂解法［3］。挑取单菌落，接种于7mlLB液体培养基（含抗生素）中，37℃、225rpm震荡培养过夜（约12～14h）。取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，4℃、12000×g离心1min，弃上清，使细菌尽可能干燥。将细菌重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡，使菌体分散。加200μl新配制的溶液Ⅱ，上下颠倒5次混匀（不要震荡），置冰上2min。加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和的混匀10s，置冰上5min。4℃、1200

6、0×g离心7min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，震荡混匀1min，4℃、12000×g离心5min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。重复上一步骤再抽提1次。加入1/10体积的3mol/LNaAc混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃、12000×g离心15min，去上清，室温干燥。70%乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥5min。沉淀溶于15μlTE（含RNAse20μg/ml）中，震荡混匀，-20℃保存备用。1.2.3感受态细胞的制备（氯化钙法）［3］从37℃过夜培养的大肠杆菌平板中挑取单一菌落，转至2mlLB液体培养

7、基中，37℃、225rpm震荡培养过夜。取培养物1：40稀释到含新鲜LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、225rpm继续震荡培养至吸光度值为0.5左右（约3h）。菌液冰浴10min，4℃、6000×g离心10min，弃上清。加1/2初始培养物体积预冷的0.1mol/LCaCl2溶液悬浮细菌，冰浴10min。4℃、6000×g离心5min，弃上清。加1/25初始培养物体积预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬浮细菌，4℃保存备用。1.