结直肠癌中黑色素瘤抗原基因mrna的表达及意义

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1、结直肠癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表达及意义【】目的检测结直肠癌组织中黑色素瘤抗原基因mage1、3和4的表达，探讨其在结直肠癌免疫治疗及作为免疫分子标志物的可行性。方法采用rtpcr方法，检测65例结直肠癌组织和相应正常粘膜组织中mage1、3和4的mrna表达，并对pcr扩增产物进行dna测序验证。结果65例结直肠癌组织标本中，53.8%（35/65)的患者至少表达一种mage基因。mage1、3、4mrna表达率分别是18.5%(12/65)、33.9%(22/65)和20%(13/65)，表达任意两种或以

2、上的mage基因的标本为27.7%(18/65)，而相应正常粘膜组织均未检测到上述基因的表达。dna测序结果表明rtpcr产物确为目的基因片段。mage基因表达与患者的年龄(除外mage1,p=0.011)、性别、cea、肿瘤大小和位置、组织分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度及tnm分期无关(p0.05)。结论结直肠癌中mage3可作为肿瘤疫苗的备选基因和免疫学检测的分子标志物，具有作为肿瘤免疫治疗特异性靶位的潜在价值，而mage1,4因表达率低限制了其应用价值。【关键词】黑色素瘤抗原基因结直肠肿瘤mrna表达黑色

3、素瘤抗原基因（melanomaantigengene，mage）是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤特异性抗原基因，主要表达于以黑色素瘤为主的恶性肿瘤组织中，现已证实在肝、胃、肺等恶性肿瘤中有较高的表达，而在正常组织（除睾丸和胎盘外）不表达[1]，其表达又与肿瘤的发生、发展及预后关系十分密切。.133229.利用这一特点可作为肿瘤免疫治疗理想的靶抗原。应用mage基因编码的抗原肽对黑色素瘤及转移瘤的肿瘤免疫治疗的实验和临床研究正在进行，并已取得较好的疗效[2,3]。但mage基因在结直肠癌中表达的研究较少且结果不一。为了解ma

4、ge基因在结直肠癌中的表达特点，我们采用rtpcr方法检测mage1、3和4在结直肠癌中表达状况，为研制结直肠癌特异性的肿瘤疫苗及开展以此为靶抗原的免疫治疗提供理论依据。1材料与方法1.1组织标本65例结直肠癌组织及相应的正常粘膜组织标本，均取自2005年7月～11月在广西医科大学第一附属医院住院手术治疗的患者。男44例，女21例；年龄30～80岁，中位年龄55.0岁。其中，高中分化腺癌57例；粘液腺癌3例，复发2例；低分化癌2例，复发1例。肿瘤分期和分级根据术后病理结果按最新国际抗癌协会tnm分期[4]，以上的正常粘

5、膜，组织大小约1cm×1cm×1cm。标本在手术切除后10min内放入液氮冻存，后转入－80℃冰箱保存。标本均经病理组织学检查证实。睾丸组织用作阳性对照。1.2方法1.2.1rna提取及逆转录用trizol提取组织总rna，紫外分光光度计测od值，以od260/od280＝1.8～2.0为rna质量判断标准。逆转录反应体系含总rna3μg，oligo(dt)180.5μg，10mmol/ldntp2μl，rnase抑制剂20u，逆转录酶200u，总体积为20μl。逆转录完毕后70℃变性10min，冰上冷却后-20℃冰箱保存

6、备用。以上所用器材均为rnasefree。gapdh用作内参照。1.2.2mage1、mage3和mage4基因的扩增（25μl反应体系）以1μlcdna为pcr扩增模板，加1.5μlmgcl2，2.5μl10×buffer，1μldntps，1μl引物(包括mage、gapdh)，0.2μltaq酶，16.8μl灭菌水。各基因的引物[5]及反应条件见表1。反应完成后取5μlpcr产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，少量溴乙锭染色鉴定。于紫外透射仪上观察电泳结果。采用biorad凝胶图像分析系统摄片。表1rtpcr

7、引物序列和反应条件1.2.3mage1、mage3和mage4基因扩增产物dna的测序随机选取三种mage基因的阳性pcr产物（各3例）进行纯化和序列测定。pcr产物纯化采用bioflux试剂盒，操作按说明进行。送上海捷瑞生物工程有限公司进行dna测序。1.2.4统计学方法应用统计学软件spss10.0对数据进行pearsonχ2检验或fisher确切概率法检验,以p0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同mage基因的表达mage1、3和4三种基因在不同结直肠癌组织标本表达情况见表2。65例结直肠癌组织标本中

8、magemrna表达频率最高的是mage3，表达率为33.9%(22/65)，mage1和mage4分别是18.5%(12/65)和20%(13/65)。内参照gapdh在所有组织标本中均有稳定表达，且强度基本一致，证实逆转录产物cdna的完整性,见图1。dna测序证实扩增条带均为目的基因。所有正