结核分枝杆菌快速药敏实验研究进展

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1、结核分枝杆菌快速药敏实验研究进展[关键词]结核分枝杆菌；药敏实验；研究进展　　[]R378.91[]B[]1005-0515（2011）-11-327-01　　　　结核分枝杆菌引起的结核病是全球范围内最普遍的慢性传染病之一，据估计全球有三分之一的人感染过结核分枝杆菌，亚洲地区占全世界受感染人群的三分之二。我国是全球22个结核病高发病国家之一，发病人数位居世界第二位，仅次于印度[1]。全国第四次结核病流行病学抽样调查显示，我国结核病疫情有高患病率、高耐药率、低递减率等特点[2]。耐多药结核分枝杆菌(multi-drugres

2、istantTB,MDR-TB)的流行扩散使结核病的治愈率大幅下降，在初治和复治患者中的治愈率分别为40%和20%[3]，严重遏制了DR-TB的关键在于早期诊断耐药菌株，及时制定有针对性的治疗方案，然而传统的结核杆菌药物敏感实验有生长依赖性，耗时长，需要6-8周才能报告实验结果，不能及时指导临床用药，因此，快速、敏感的结核杆菌药物敏感实验的研究成为全球关注的焦点，本文主要从快速的表型药敏实验和分子药敏实验两个方面进行综述。　　1表型药敏实验　　1.1氧化还原指示剂法(redox-indicatormethods)在接种有结

3、核菌的液体培养基中加入各种不同浓度抗结核药物及氧化还原指示剂，孵育一定时间后，根据指示剂是否发生颜色改变来判断是否有该菌株生长，如指示剂发生还原反应，则提示有结核菌生长，说明该菌株在此药物浓度下对此种药物耐药。常用的指示剂有XTT、刃天青等。此法不需特殊仪器，成本低廉，平均10天即可回报结果，敏感性和特异性分别为91%和71%[4]，不足之处是特异性不强，容易因杂菌污染而导致假阳性结果。　　1.2噬菌体生物扩增法(Phageamplifiedbiologicallyassay,PhaB)结核分枝杆菌噬菌体能感染活的结核分枝

4、杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活,进入菌体内的噬菌体在菌体内大量增殖,最终将菌体裂解,在琼脂平板上出现透明的噬菌斑。加入抗结核药物的培养基内由于药物对结核菌的抑制，噬菌体不能感染死亡的菌体，导致噬菌斑不能形成，故而表现为敏感；反之，有噬菌斑形成的则为耐药菌株。该方法48小时内就可回报结果[5]。由于采用的结核杆菌噬菌体不同，导致该方法在临床应用中敏感性及特异性差异较大。　　1.3显微镜观察药物敏感度检测技术(microscopicobservationdrugsusceptibility,MODS)MO

5、DS技术是一种对结核杆菌形态学进行显微镜观察和耐药性检测的一种液态培养方法。在液体培养基中，结核杆菌能够分泌索状因子，使其呈现特征性索状结构，该结构可通过倒置显微镜进行观察，确定是否有结核杆菌生长，以及对药物是否敏感。以传统的吕氏培养法做为金标准，Jin[6]等人用MODS法检测了66株结核杆菌对4种一线抗结核药物：链霉素、异烟肼、利福平及乙胺丁醇的耐药情况，其敏感性分别为：97.0%，90.9%，95.5%和86.4%，说明MODS方法在耐多药结核杆菌的检测中有良好的应用前景。　　2分子药敏实验随着分子生物学技术的发展，

6、结核杆菌耐药的分子机制研究逐步深入，相关耐药基因的直接检测逐步成为研究热点。编码结核菌RNA聚合酶β亚基的rpoB突变使该酶活性改变，不能与利福平结合，因而表现为对利福平耐药。在临床分离的耐药结核菌中，86%的耐药株有rpoB的突变[7]。由于异烟肼和利福平是临床最常选用的一线药物，约90%的结核杆菌耐利福平同时也对异烟肼耐药，因此rpoB的突变的检测可作为耐多药结核杆菌的筛查实验[8]。katG及inhA调控区域的突变分别与异烟肼的高、低水平耐药密切相关[9]，但各国报道的突变率从50%-90%不等，说明存在种族及地区差

7、异。其它药物的耐药机制出现频率相对较低，在分子药敏实验中的作用并不十分突出。以上述基础理论研究为基础，建立了许多检测耐药结核菌突变基因的分子药物敏感实验，无需培养，可直接检测各种标本，故又称为直接药敏实验。　　2.1PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)分析通过检测DNA在限制性内切酶切割段落后形成的特定DNA片段的大小，来判断基因是否有突变。不足之处是只能根据已知突变位点来选择限制性内切酶，因此目前常用于katG315和embB

8、306突变的检测[10-11]。RFLP分析对样品纯度要求高，样品的用量大，多态性水平几乎完全依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之步骤繁琐、工作量大、成本较高，不适于临床样本的耐药性监测。　　2.2DNA测序是检测基因突变的金标准，常作为其它实验方法的验证实验，并不适用于分析样本量巨大的临床标本。　　2