革兰阴性杆菌产超广谱β内酰胺酶的分布及基因型

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　　革兰阴性杆菌产超广谱β内酰胺酶的分布及基因型孟灵张润玲尤崇革王应芳【摘要】　　目的：了解临床分离的革兰阴性杆菌中产ESBLs的流行特征及ESBLs基因型.方法：对我院临床分离的革兰阴性杆菌，采用改良三维试验检测产ESBLs菌株，用PCR对ESBLs基因进行分型.结果：175株革兰阴性杆菌分离出49株产ESBLs菌，阳性率28%，包括大肠埃希菌、克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、弗劳地枸椽酸杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌.其中，第一位是阴沟肠杆菌（34.7%，17/49），其次是大肠埃希菌（30.6%，15/49）.每种细菌产ESBLs率前三位是阴沟肠杆菌（56.6%，17/30），大肠埃希菌（37.5%，15/40），肺炎克雷伯菌（25.0%，6/24）.各病区中神经科产ESBLs菌分离率最高(32.7%).49株产ESBLs菌携带TEM，SHV，CTXM分别为34，5，16株，有17株同时携带两种β内酰胺酶基因的菌株，占34.7%,其中TEM+CTXM型13株，占基因双阳性菌株的76.5%.结论：我院产ESBLs菌以阴沟肠杆菌、大肠埃希菌为主.神经科是主要产ESBLs菌的病区.ESBLs基因以TEM型、CTXM型为主，携带双基因的菌株在我院有流行.【关键词】革兰阴性杆菌β内酰胺酶类三维试验基因型0引言超广谱β内酰胺酶（Extendedspectrumbetalactamases，ESBLs）是质粒介导的由β内酰胺酶(BLA)基因突变而形成的一类酶，是丝氨酸蛋白酶的衍生物.它可水解头孢噻肟(CTX)，头孢他啶(CAZ)等三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素，并可被β内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制〔1〕.自1983年德国首次从臭鼻克雷伯杆菌中分离出SHV2基因型ESBL以来，其数量及种类已在世界各地迅速增长.ESBLs基因型主要分为SHV,TEM,CTXM,OXA型和其他型，目前已发现200多种().不同的国家、地区、医院因其使用抗生素的种类和剂量不同,产ESBLs细菌的检出率、耐药性、基因型也有所差异.为了解兰州大学第二医院革兰阴性杆菌产ESBLs的流行状况和基因分型，我们对49株革兰阴性杆菌进行了ESBLs的确认及其基因型测定.1材料和方法1.1材料头孢噻肟（CTX，30μg/片），头孢硝噻吩纸片（Nitrocefin），MH琼脂购自英国Oxiod公司；克拉维酸（山西威奇达药业有限公司）,氯唑西林(山西博康药业有限公司 )；TaKaRa质粒DNA纯化盒，TaKaRaPCR扩增盒，DNAMarkerD3405A，引物购自宝生物（大连）有限公司.PCR分析仪（美国PERKINELMER），凝胶成像仪（德国Herolab），ABIDNA测序仪（美国PE），电泳仪（北京六一仪器厂）.大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌700603（卫生部临检中心）.200505～09我院临床分离菌175株革兰阴性杆菌.1.2方法1.2.1改良三维试验对待测菌株利用冻融法获取粗酶提取液，滤菌器过滤后测定β内酰胺酶呈阳性待用.将CTX纸片贴于涂布了大肠埃希菌ATCC25922的MH平板中央，具其5mm处用刀片向外分别切四个裂隙，在各裂隙中分别加入待测粗酶液（30μL），粗酶液（30μL）+克拉维酸液（2mmol/L10μL），粗酶液（30μL）+氯唑西林液（2mmol/L10μL），粗酶液（30μL）+克拉维酸液（2mmol/L10μL）+氯唑西林液（2mmol/L10μL），35℃过夜培养.1.2.2ESBLs基因型酶（TEM,SHV,CTXM1型）PCR扩增①引物设计：TEM型T1(5＇ATAAAATTCTTGAAGACGAAA3＇),T2(5＇GACAGTTACCAATGCTTAATCA3＇)，终产物1075bp；SHV型S1(5＇GGGTTATTCTTATTTGTCGC3＇),S2(5＇TTAGCGTTGCCAGTGCTC3＇)，终产物928bp；CTXM1型C1(5＇GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC3＇),C2(5＇CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTCG3＇)终产物826bp.②质粒提取：挑选待测菌单个菌落接种至2.5mL含有氨苄西林(50mg/L)的LB培养基35℃过夜培养，经23000g离心2min，沉淀物采用碱裂解法提取质粒DNA.③反应体系：引物各0.25μL，10×PCRBuffer(+)(Mg2+PLus)5μL，dNTP4μL，Taq酶0.25μL，质粒模板2μL，加去离子水至50μL.④反应参数：TEM型变性94℃45s，退火50℃45s，延伸72℃1min共30个循环；SHV型变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min共30个循环；CTX–M型变性94℃45s，退火59℃45s，延伸72℃1min共30个循环.1.2.3PCR产物测序PCR产物送宝生物（大连）有限公司，采用Sanger双脱氧链终止法测序，结果直接在GenBank中（.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列比对分析.1.2.4PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物点样于40g/L聚丙烯酰胺凝胶，以8V/cm的电压下进行电泳30min后，经0.5mg/L溴化乙锭染色，凝胶置于凝胶成像仪摄像.2结果 2.1产ESBLs革兰阴性杆菌的菌株分布175株临床分离菌株检出49株ESBLs表型阳性菌，阳性率28%.产ESBLs菌株中，最常见的是阴沟肠杆菌，其次是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，最少见的是弗劳地枸橼酸菌(表1).各类革兰阴性杆菌产ESBLs率最高为阴沟肠杆菌，其次是大肠埃希菌、克雷伯菌属，铜绿假单胞菌产ESBLs率最低.表1革兰阴性杆菌产ESBLs的分离率2.2产ESBLs革兰阴性杆菌的科室分布产ESBLs菌在医院各科室广泛存在，神经科中比例最高，达32.7%(表2).表249株产ESBLs菌的病区分布2.3产ESBLs革兰阴性杆菌基因分型携带TEM型β内酰胺酶基因的菌株为34株（69.3%），携带SHV型、CTXM型基因的菌株分别为5株（10.2%）、16株（34.7%），其他型别11株（22.4%）.其中，有17株同时携带两种β内酰胺酶基因的菌株，占34.7%，TEM+CTXM型13株（26.5%），TEM+SHV型3株（10.2%），SHV型+CTXM1株（2.0%）.各型PCR扩增产物电泳见图1，菌株详细ESBL基因分型.3讨论　　产ESBLs菌株主要引起医院感染和流行.从对本院的研究表明，我院产ESBLs菌分布范围广，分离率高.其中所占比例最高的是阴沟肠杆菌（34.7%），其次是大肠埃希菌（30.6%）.近年来，我国各地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离率，一般在15%～35%左右〔2〕，2003年以来，部分城市已高达40%〔3〕.本研究产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分离率分别是37.5%,25%，与全国水平相当.各地区对产ESBLs阴沟肠杆菌的分离率差异较大，佘丹阳等〔4〕在106株阴沟肠杆菌中发现单纯产ESBLs占10.4%（11/106），肖庆忠等〔5〕报告阴沟肠杆菌产ESBLs达55.2%（117/212），本院阴沟肠杆菌产ESBLs率高达56.6%，与广州地区相似，可能与本院菌株分布，用药种类不同或存在局部流行有关.　　我院多个科室中均分离到ESBLs菌，表明全院面临产ESBLs菌感染的威胁，应引起高度重视.其中，ESBLs菌在神经科最常见（32.7%）.推测原因神经科入住的危重患者多，第三代头孢菌素使用量较大，在抗生素的选择性压力下，导致了ESBLs产生株增多.　　PCR结果表明本院产ESBLs革兰阴性杆菌主要产TEM型β内酰胺酶，以大肠埃希菌和阴沟肠杆菌为主，其次是CTXM型，主要集中于阴沟肠杆菌.本院SHV型β内酰胺酶少见，主要由克雷伯菌属产生.产TEM型、CTXM型β 内酰胺酶在鲍曼不动杆菌检出，但不排除存在其他型别的可能.李蓉等〔6〕检测15株鲍曼不动杆菌主要为TEM型、PER型β内酰胺酶基因和OXA23型碳青霉烯酶基因.本研究中三株铜绿假单胞菌均不含blaTEM,blaSHV,blaCTX，说明可能为其他型别，有待进一步研究.有报道，铜绿假单胞菌最常见为PER型〔3〕.值得关注的是，本院产ESBLs菌TEM,SHV,CTX基因双阳性的比率达34.7%，表明产ESBLs菌携带两种β内酰胺酶耐药基因是我院的流行特点.其中，阴沟肠杆菌TEM型和CTXM型阳性占52.9%（17/9），多个耐药基因的存在造成阴沟肠杆菌的耐药谱扩大〔7〕.北京张永利等〔8〕在12株阴沟肠杆菌中检出5株同时携带blaTEM,blaCTX，推测产ESBLs菌可通过质粒进行细菌间耐药基因的交换，同一菌株质粒上有2种或2种以上ESBLs编码基因.　　本研究我们发现CTXM型β内酰胺酶在我院有流行,具有重要的意义.国内报道产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型主要是CTXM型〔9〕，与我国头孢噻肟用量多于其他三代头孢菌素有关.我院头孢噻肟的用量也有此特点.CTXM型ESBLs菌株可通过转座子从染色体转移至质粒，并通过质粒使耐药性广泛传播,从而存在爆发流行的潜在性.因此，临床要避免滥用抗生素，重视细菌耐药的检测，控制耐药菌株的传播，减少医院感染的发生.【