褪黑素对癫痫大鼠海马内P 物质受体水平的影响

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1、研究生毕业论文褪黑素对癫痫大鼠海马内P物质及P物质受体水平的影响中文摘要癫痫(Epilepsy)是中枢神经系统的常见病和多发病,是中枢神经元反复阵发性过度放电的结果。癫痫患者脑内兴奋性系统与抑制性系统失去平衡是癫痫发作的主要神经机制。褪黑素（melatonin,MT）是一种主要由丘脑松果体细胞合成、分泌的吲哚类神经内分泌激素。研究表明，MT能通过细胞膜上的特异性的MT受体发挥其抗癫痫作用，海马及其亚区域内GABA神经元也能表达MT受体，这样MT能通过增强GABA及其受体活性，抑制或减弱癫痫的发作，保护脑

2、神经。而MT膜受体竞争性拮抗剂Luzindole能够阻断MT的抗惊厥作用、抑制癫痫发作的作用。P物质（SubstanceP,SP）属于速激肽家族，能参与癫痫的发作。大量研究发现P物质能与抑制性神经递质GABA共存于海马主要神经元。以上这些提醒我们MT的抑痫过程中可能会对SPSPR产生影响。但是目前MT的抗痫作用机制尚未完全阐明。为进一步研究MT的抑痫作用，本研究在马桑内酯致痫的癫痫大鼠模型基础上，采用免疫细胞化学和RT－PCR方法，从细胞和基因水平观察了MT对癫痫大鼠海马内SP及SPR水平的变化，以进

3、一步探讨MT的抑痫作用机制。首先，免疫组化用40只健康SD雄性大鼠，随机分为四组，每组10只，分别为A组：生理盐水对照组；B组：马桑内酯致痫组；C组：褪黑素＋马桑内酯组；D组：Luzindole＋褪黑素＋马桑内酯组。参照Smialowaki的评论标准分级，观察记录大鼠行为学表现，用免疫组化方法（SABC法）检测海马内SP及SPR含量的变化，最后再用20只健康SD雄性大鼠（每组5只，动物模型及分组与免疫组化1医学院硕士研究生毕业论文相同），采用SYBRGreen1荧光PCR方法，对各组大鼠海马内SPmRN

4、A进行相对定量后，在基因水平比较MT对SPmRNA表达的影响。结果显示，行为学表现上：A组几乎无癫痫发作的表现和痫样放电，B组D组几乎都有癫痫发作且发作程度极强（Ⅳ－Ⅴ级），发作持续时间长。而A、C组大鼠几乎无癫痫发作或仅有轻微发作表现；免疫化学观察：各组大鼠海马CA1－CA3区锥体细胞层和DG颗粒细胞层神经元中均有SP与SPR免疫阳性表达。在高倍光镜下，SP阳性细胞表达于神经元胞体的胞浆中，胞核空染。在高倍镜下，SPR阳性细胞表达于神经元细胞胞体的胞浆及轴突中，胞核空染。还可见较长神经纤维深染。检测S

5、P的各组之间比较：B组（CL组）、D组（LU组）SP的免疫反应明显强于A组（对照组）（P＜0.05），C组与B组、D组相比SP阳性细胞免疫明显减弱，阳性细胞着色变浅，数目减少，统计学结果P＜0.05，认为有明显差别。C组与对照相比没有明显差别（P＞0.05）。检测SPR的各组之间比较：B组（CL组）、D组（LU组）SP的免疫反应明显强于A组（对照组）（P＜0.05），C组与B组、D组相比SP阳性细胞免疫明显减弱，阳性细胞着色变浅，数目减少，统计学结果P＜0.05，认为有明显差别。C组与对照相比没有明显差

6、别（P＞0.05）。实时荧光定量PCR采用－2CT法计算各组SP基因表达的差异，B组或D组大鼠与A组相比，海马内SPmRNA明显升高，统计学结果P＜0.05。C组大鼠与B组或D组相比，海马内SPmRNA相对含量明显减少，统计学结果P＜0.05。C组大鼠与生理盐水对照组比几乎无差别统计学结果P＞0.05。本实验结果显示，CL致痫组大鼠海马内SP/SPR含量明显升高，SP/SPR确实参与癫痫发作。在使用褪黑素预处理大鼠后，大鼠在癫痫发作严重程减弱，癫痫发作的耐受性明显增强。免疫组化所示：褪黑素预处理的大鼠

7、海马内，SP免疫反应明显减弱。基因水平的检测显示：褪黑素能减少癫痫大鼠脑内SPmRNA的量。行为学表现、形态学表现、基因水平的检测结果都互相吻合。而先用MT受体拮抗剂Luuzindole预处理的大鼠癫痫发作再次增强，海马内SP/SPR表达比C组大鼠明显增强，说明MT是通过其特异性受体发挥抑痫作用的。因此我们认为，褪黑素的抑制癫痫作用机制中，确实有对SP及SRR的参与。MT可能通过与特异性的G蛋白膜受体结合后，调节大鼠海马内SP及SRR的含量及活性来抑制癫痫发作。2医学院硕士研究生毕业论文综上所述，MT对

8、马桑内酯致痫大鼠有明显的抑制作用，可能通过的调节SP和SPR的水平和活性，进而调节Glu神经元，来实现抑制癫痫发作作用。本实验不仅为MT抑制动物癫痫发作提供了明确的实验依据，为阐释其抑痫机制开辟了新视角，也为MT应用于癫痫发作提供了可能。然而我们认为，MT对脑内SP和SPR水平的调节只是MT抑痫作用途径之一，有关其抑痫作用的其他途径及与此途径的关系等问题尚待进一步研究。关键词褪黑素；癫痫；SP；SPR；免疫组织化学；SYBRGreen1荧